趙微，陳小宇，于蘭，丁楊芳，夏源，鄭秋生,*

(1 石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000；2 濱州醫(yī)學院中西醫(yī)結合學院，山東 煙臺 264000)

惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是皮膚腫瘤中惡性程度最高的腫瘤[1]，其主要生物學特征是侵襲和轉移[2]，50%～80%的晚期黑色素瘤患者會發(fā)生肝轉移，8%～46%的黑色素瘤患者會發(fā)生腦轉移[3]，發(fā)生轉移的晚期黑色素瘤患者中位生存時間僅為8 ～ 9個月，5年生存率不足5%[4]。全球每年新發(fā)皮膚惡性黑色素瘤約20余萬例,而中國每年新發(fā)病例達2萬余例[5]，因此黑色素瘤已成為嚴重危及我國人民健康的疾病之一，如何有效地抑制黑色素瘤細胞的遷移和侵襲也成為臨床治療成功的關鍵。

研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤具有高度活躍的糖酵解進程，且丙酮酸激酶同工酶2(PKM2)呈過表達狀態(tài)[6]，這提示我們PKM2可能是抑制黑色素瘤侵襲與轉移并能有效治療黑色素瘤的潛在靶點。越來越多的研究表明，天然產物在腫瘤的治療中通過抑制糖酵解表型及遷移而發(fā)揮著積極的作用[7]。新狼毒素A(Neochamae jasmin A，NCA)是從植物瑞香狼毒StellerachamaejasmeL.根中提取分離得到的黃酮類化合物[8]，具有較強的體內外抗腫瘤作用[9-10]，其抗癌譜廣、不良反應小，可以通過調節(jié)細胞周期等特定的分子途徑抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導細胞的凋亡[11]，然而關于NCA對黑色素瘤B16F10細胞的增殖、侵襲及其相關機制的研究尚未有明確報道。因此，本研究主要揭示NCA對小鼠黑色素瘤B16F10細胞糖酵解和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

小鼠黑色素瘤B16F10細胞(購買于中國科學院上海生命科學院細胞資源中心)。

1.1.2 藥品與試劑

NCA(純度≥98%，Chemaces公司，武漢)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich公司，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，中國)；青霉素-鏈霉素混合溶液(HyClone公司，美國)；胰蛋白酶(北京索來寶科技有限公司，中國)；DMEM低糖培養(yǎng)基(Gibco公司；美國)；葡萄糖測定試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，中國)；ATP含量測試盒、乳酸含量測定試劑盒、乳酸脫氫酶含量測定試劑盒、丙酮酸激酶含量測定試劑盒、己糖激酶含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)；RNA提取試劑盒、瓊脂糖B、引物合成(上海生工生物工程有限公司，中國)；cDNA逆轉錄試劑盒(賽默飛世爾公司，美國)；2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技(北京)有限公司，中國)。

1.1.3 儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo 3131，美國賽默飛世爾公司)；多功能酶標儀(Thermo 3001，美國賽默飛世爾公司)；倒置生物顯微鏡(BDS200-PH，重慶奧特光學儀器有限公司)；化學發(fā)光檢測成像系統(tǒng)(美國Ultra-Violet產品有限公司)；PCR擴增儀(Bio-Rad)；恒流恒壓電泳儀(Bio-Rad)。

1.2 細胞培養(yǎng)及儲備液配置

將小鼠黑色素瘤B16F10細胞與含有10%的血清和1%青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM低糖培養(yǎng)基在37 ℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育；5 mg的新狼毒素A(NCA)經92.75 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解后配置成1×105μmol·L-1的NCA母液，放置于-20 ℃保存。實驗中的DMSO終濃度均小于0.1%。

1.3 細胞活力測定

將對數(shù)生長期的B16F10細胞，經胰蛋白酶消化后以8 × 104個·mL-1接種于96孔板中，培養(yǎng)至細胞長到70%融合度后，吸出舊培養(yǎng)液，分別加入200 μL含NCA的培養(yǎng)基，至終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，在每孔液面上加入50%(質量/體積) 的三氯乙酸(TCA)50 μL固定細胞(TCA的終濃度為10%)，然后在4 ℃冰箱中放置1 h，培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA；空氣中過夜干燥，隨后每孔加0.4%的黃酰羅丹明B (SRB) 100 μL，室溫下放置20 min，棄去各孔內液體(回收)后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中干燥后加入150 μL DMSO(二甲基亞砜)，在平板振蕩器上振蕩5 min，用Thermo 3001多功能酶標儀OD 490 nm測量各孔的吸光值[12]。按下式計算藥物對細胞增殖的抑制率：

抑制率/%=

1.4 細胞劃痕實驗

用劃痕實驗檢測NCA對腫瘤細胞遷移運動能力的影響[13]，即收集對數(shù)生長期細胞，調整單細胞懸液濃度至1.0 × 105個·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板，至細胞長到70%融合度，以200 μL無菌吸頭均勻劃痕，用PBS輕輕洗去脫落的細胞，再于各組分別加入含不同濃度NCA的培養(yǎng)基，其終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h至正常(control)組劃痕基本愈合。用ZEISS倒置顯微鏡拍照并分析。采用Image-Pro plus軟件分別測定各組劃痕前后寬度，按照如下公式計算劃痕愈合率。

劃痕愈合率/%=

1.5 B16F10細胞中ATP含量測定

在肌酸激酶的催化作用下，三磷酸腺苷(ATP)與肌酸生成磷酸肌酸，磷酸肌酸又可用于ATP的再合成為細胞提供大量能量儲備，維持細胞內的能量代謝，通過磷鉬酸比色法在700 nm處測得磷酸肌酸的含量，以反映ATP的生成水平。

以此為原理，取對數(shù)生長細胞，制成細胞懸液，計數(shù)并調整細胞懸液的濃度為1.0 × 105個·mL-1，接種于在6孔板上，至細胞長到70%融合度，給予NCA使其終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，藥物作用24 h后終止培養(yǎng)。離心處理將細胞和上清分離，收集下層細胞沉淀，在收集好的細胞中加入300-500 μL熱雙蒸水，置于熱水浴(90～100 ℃)中勻漿破碎細胞，然后將細胞裂解液于沸水浴中加熱10 min，取出混勻抽提(渦旋混勻)1 min，按照ATP含量測定試劑盒說明書指導進行混勻，室溫靜置5 min，在636 nm，0.5 cm光徑，雙蒸水調零，測定吸光度值，按照如下公式計算細胞中ATP的含量。

1.6 細胞乳酸(LD)含量測定

多數(shù)腫瘤細胞即使在氧氣條件充足的情況下，仍然選擇有氧糖酵解作為主要供能方式，其主要特征是葡萄糖消耗增加以及乳酸生成增多[3]。

當細胞培養(yǎng)至80%～90%融合度時，消化細胞后將B16F10細胞調整為1 × 105個·mL-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，加入不同濃度的含NCA的培養(yǎng)基，其終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，在5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。在乳酸測定過程中，乳酸脫氫酶能夠催化乳酸產生丙酮酸，作為氫受體的NAD+轉化為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。

其中吩嗪硫酸甲酯(PMS)遞氫使氯化硝基四氮唑藍(NBT)還原為紫色呈色物，呈色物的在530 nm的吸光度與乳酸含量成線性關系，以此為原理，按照乳酸(Lactic acid)測定試劑盒說明書指導，進行乳酸含量測定，計算公式如下：

1.7 細胞培養(yǎng)液中葡萄糖(GOD)含量測定

當細胞培養(yǎng)至80%～90%融合度時，消化細胞后將B16F10細胞調整為1 × 105個·mL-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，加入不同濃度的含NCA的培養(yǎng)基，其終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，在5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。根據(jù)著名的Trinder反應(Trinder，1969；Barham，1972)，其原理為葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD)作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫(H2O2)；過氧化物酶(POD)催化H2O2，色原物質生成紅色醌亞胺類化合物，顏色的深淺與葡萄糖含量成正比。以葡萄糖氧化酶法檢測試劑盒說明書為指導，測得葡萄糖含量，計算公式如下：

1.8 丙酮酸激酶(PK)的活性測定

丙酮酸激酶(PK)作為糖酵解途經中三個限速酶之一，在糖酵解中發(fā)揮了重要的作用[14]。PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，因此PK活力的大小在很大程度上反映了糖酵解的水平，通過在340 nm下測定NADH下降速率，即可反映PK活性。

以此為原理，收集對數(shù)生長期細胞，調整單細胞懸液濃度至1.0×105個·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度NCA的培養(yǎng)基，其終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，按丙酮酸激酶(PK)測定試劑盒說明書的指導并根據(jù)下列PK活性的計算公式測得細胞中PK的活性。

1.9 己糖激酶(HK)的活性測定

作為糖酵解途徑中限速酶的己糖激酶(HK)，不僅可以在葡萄糖磷酸化過程中發(fā)揮作用，還能促進線粒體產生ATP，從而加速糖酵解進程[15]，根據(jù)6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD)的偶聯(lián)反應，在提供足量的底物條件下生成NADPH，通過在340 nm處測定吸光度，吸光度值的增加值可以反映己糖激酶(HK)的活性。

因此，使用己糖激酶(HK)測定試劑盒，收集對數(shù)生長期細胞，調整單細胞懸液濃度至1.0×105個·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度NCA的培養(yǎng)基，其終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，照說明書的指導及下列HK活性計算公式測得細胞中HK的活性。

1.10 乳酸脫氫酶(LDH)的活性測定

在糖酵解進程中，乳酸脫氫酶(LDH)的主要功能是催化生成乳酸，抑制其表達可有效地抑制腫瘤地發(fā)生發(fā)展，因此被廣泛認為是用于治療腫瘤的極具前景的靶點[14]，而LDH在輔酶I的遞氫作用下，使乳酸脫氫生成丙酮酸，NAD+還原成NADH引起了340 nm處吸光度值的改變。

以此為原理，收集對數(shù)生長期細胞，調整單細胞懸液濃度至1.0×105個·mL-1，接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度NCA的培養(yǎng)基，其終濃度分別為0、10、20、30、40 μmol·L-1，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，按照乳酸脫氫酶(LDH)說明書指導處理各組份細胞，測得LDH酶活性，計算公式如下：

1.11 GLUT1、LDHA、PKM2、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達的測定

B16F10細胞經不同濃度的NCA(0、10、20、30、40 μmol·L-1)處理24 h后，加入1 mL Trizol分離核蛋白與核酸分離，參照UNIQ-10柱式總RNA提取試劑盒說明書指導提取細胞總RNA，測得RNA濃度后定量。

根據(jù)cDNA逆轉錄試劑盒的說明進行逆轉錄反應，得到逆轉錄產物cDNA，使用2×Taq PCR Master Mix將cDNA 在95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，根據(jù)引物的不同選擇不同溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)38次后于72 ℃延伸5 min，得到PCR產物，經瓊脂糖凝膠電泳后，將其成像并在紫外線下成像、拍照,引物序列如表1所示。

表1 引物序列表

1.12 統(tǒng)計學分析

所有試驗設3個平行組或重復3次，結果以平均值±標準偏差(Mean values ± SD)表示，以t檢驗進行組間統(tǒng)計學差異比較，以*P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學意義，**P<0.01為差異具有非常顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NCA抑制B16F10細胞增殖

NCA以不同濃度(0、10、20、30、40 μmol·L-1)分別作用于B16F10細胞24 h及48 h后，抑制率呈明顯的量效關系。如圖1所示：當藥物干預24 h后，NCA在濃度為10 μmol·L-1時就能顯著抑制B16F10細胞的增殖，并呈劑量依賴性和時間依賴性。(IC5024 h=28.60 μmol·L-1；IC5048 h=18.51 μmol·L-1)。

*P<0.05，**P<0.01。

2.2 NCA抑制B16F10細胞遷移

不同濃度NCA(0、10、20、30、40 μmol·L-1)處理24 h后，B16F10細胞愈合率隨給藥濃度增大顯著下降，由此得出NCA可有效抑制細胞遷移且呈劑量依賴性(圖2)。

*P<0.05，**P<0.01。

2.3 NCA抑制B16F10細胞ATP的生成

不同濃度NCA(0、10、20、30、40 μmol·L-1)處理B16F10細胞24 h后，細胞中的ATP水平受到抑制，且隨著NCA濃度的增大ATP水平逐漸降低，表明NCA降低了細胞ATP的水平(圖3)。

*P<0.05，**P<0.01。

2.4 NCA減少B16F10細胞乳酸生成

不同濃度的NCA(0、10、20、30、40 μmol·L-1)處理B16F10細胞24 h后，細胞培養(yǎng)液中的乳酸含量隨著新NCA濃度的增大而減小，與對照組相比較，高濃度NCA(30 μmol·L-1和40 μmol·L-1)能夠顯著抑制B16F10細胞中乳酸生成(圖4)。

*P<0.05，**P<0.01。

2.5 NCA減少B16F10細胞葡萄糖的攝取

不同濃度的NCA(0、10、20、30、40 μmol·L-1)作用于B16F10細胞24 h后，細胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量隨著NCA濃度的增大逐漸增多，細胞攝取葡萄糖的能力逐漸減弱，與對照組相比，NCA處理組具有顯著性差異(圖5)。

*P<0.05，**P<0.01。

2.6 NCA抑制己糖激酶(HK)，丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)的活力

如圖6所示，NCA干預B16F10細胞后，與對照組相比，NCA顯著抑制了B16F10細胞內HK、PK、LDH的活力，表明NCA可能通過抑制糖酵解相關酶，下調了B16F10細胞內的糖酵解水平，從而抑制B16F10細胞的增殖和遷移。

*P<0.05，**P<0.01。

2.7 NCA下調GLUT1、LDHA、PKM和MMP-2、MMP-9的表達，上調TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達

不同濃度的(0、10、20、30、40 μmol·L-1)NCA處理B16F10細胞24 h后，RT-PCR檢測NCA對B16F0細胞GLUT1、LDHA、PKM和MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達的影響，結果如圖7所示，NCA能下調GLUT1、LDHA、PKM2和MMP-2、MMP-9的表達，上調抑制因子TIMP-1、TIMP-2的表達。

3 討論

糖代謝的異常被認為是腫瘤的十大特征之一[15]，獲得足夠的能量對腫瘤細胞生長增殖至關重要[16]，早在上世紀20年代，德國科學家Warburg 發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞無論是否有氧氣存在都主要依賴糖酵解進行代謝，大量消耗葡萄糖的同時并伴有乳酸的產生，這一現(xiàn)象稱為“糖酵解或Warburg效應”[17]。糖酵解產生的大量乳酸維持了腫瘤細胞內酸性微環(huán)境，進而導致細胞基質的不穩(wěn)定性，產生大量核酸前體，腫瘤細胞為逃避酸性的生存環(huán)境，便趨利避害的選擇向正常的組織侵襲，從而助于腫瘤細胞的增殖、耐藥、侵襲和轉移[18-19]，因此，抑制惡性腫瘤細胞糖酵解進程也可能是中藥成分抑制腫瘤增殖遷移的機制之一。

NCA作為中藥狼毒中具有較強抗腫瘤作用的有效成分[9]，能以時間劑量依賴性的抑制黑色素瘤高轉移細胞株B16F10細胞的增殖及劃痕愈合；MMP-2和MMP-9作為基質金屬蛋白酶家族的成員，在NCA的作用下表達水平下降，而抑制因子TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達增強，說明B16F10細胞的轉移能力減弱[20]；腫瘤轉移能力除了與細胞降解外基質的關鍵酶(如基質金屬蛋白酶)有關，還與細胞上皮細胞間質轉型(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)密切相關[21]，這提示我們，NCA對于B16F10細胞EMT具有抑制作用。

大量研究表明，EMT大多與高度活化的糖酵解進程相關從而促進腫瘤細胞的增殖與轉移[19,21]，如乳腺癌MCF-7細胞發(fā)生EMT后，GLUTI表達增強且葡萄糖攝取量增加[22]；胰腺導管癌細胞發(fā)生EMT的同時伴隨GLUTI和LDH的增加[20]。在高度活化的糖酵解過程中，腫瘤細胞依賴Warburg效應的根本機制就是對關鍵酶的調節(jié)，過量表達糖酵解途徑的關鍵酶能夠誘發(fā)Warburg效應[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，當我們對B16F10細胞給與NCA處理時，B16F10細胞發(fā)生EMT抑制的同時GLUT1、LDHA及PKM2的表達減弱；細胞攝取葡萄糖的能力、乳酸生成量與ATP的水平均受到抑制；同時與其密切相關的關鍵酶(PK、HK、LDH)的活力抑制影響了B16F10細胞的Warburg效應，沒有足夠ATP的生成，腫瘤細胞增殖所需的核苷酸和脂肪酸生成減少[24]，進而抑制B16F10細胞的增殖遷移。

綜上所述，我們初步認為NCA對B16F10細胞增殖遷移的抑制作用可能與抑制糖酵解表型有一定的相關性。對于開發(fā)新藥用于治療黑色素瘤這樣具有高度增殖、轉移能力的腫瘤而言，探究其是否能夠調控糖酵解途徑具有十分重要的意義。然而僅僅通過調控糖酵解途徑的某一個靶點并不足以抑制腫瘤細胞的生長增殖，研究NCA對于B16F10細胞糖酵解進程的目的在于從多個方面探究其作用機制從而更好的開發(fā)理想的靶向藥物，相信在世界科技水平的不斷提升及科研人員的不懈努力下，惡性腫瘤這個難題終將被攻克！