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        持續(xù)外源一氧化氮處理對黃瓜(Cucumis sativus L.)幼苗生長發(fā)育及耐冷性的影響

        2020-11-20 07:25:58張文博楊志峰吳佩趙明偉劉慧英崔金霞
        關(guān)鍵詞:外源葉面積黃瓜

        張文博,楊志峰,吳佩,趙明偉,劉慧英,崔金霞

        (石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832003)

        低溫脅迫是限制植物分布和產(chǎn)量的重要因素之一。植物在低溫脅迫下的生理生化變化主要表現(xiàn)為葉綠素合成受阻[1]、細(xì)胞收縮、膜系統(tǒng)受損、膜脂從液晶態(tài)變成凝膠態(tài),導(dǎo)致離子發(fā)生外滲、細(xì)胞導(dǎo)電性發(fā)生變化,進(jìn)而體內(nèi)各種代謝發(fā)生紊亂?;钚匝?ROS)參與細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng),正常情況下,ROS分子能夠被氧化防御機(jī)制清除,即植物的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)[2]。一旦植物受到低溫等逆境脅迫時(shí),活性氧的動(dòng)態(tài)平衡被打破,從而對植物造成傷害[3]。NO是一種易穿過生物膜,幾乎不含極性的親脂性分子。植物體內(nèi)NO的產(chǎn)生主要有硝酸還原酶(NR)、一氧化氮合酶(NOS)途徑和非酶促途徑[4]。研究[5]已證實(shí)NO在植物中是一種關(guān)鍵的信號分子參與植物體內(nèi)多種生理代謝,包括促進(jìn)植物生長發(fā)育、延緩葉片衰老、刺激防御相關(guān)基因的表達(dá),并在逆境中具有抗氧化的作用。Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn),擬南芥內(nèi)源NO的產(chǎn)生與低溫馴化呈正相關(guān)關(guān)系,并且NO合成的迅速增加伴隨著冷應(yīng)答基因的表達(dá)。也有研究[7]表明ROS中的H2O2可以作為信號分子參與植物的防御反應(yīng),并可以與NO信號分子互作來提高植物的抗逆性。

        植物在生長發(fā)育過程中遭受低溫、干旱等逆境脅迫后,能夠通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合,精確調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),并通過基因產(chǎn)物的作用對外界信號在生理生化等方面做出合適的調(diào)節(jié)反應(yīng),提高自身的耐性以維持生存[8]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族能響應(yīng)低溫脅迫,Ling等[9]研究表明黃瓜中共發(fā)現(xiàn)有57個(gè)WRKY家族基因,有一些WKRY轉(zhuǎn)錄因子參與到低溫脅迫中。

        近年來,將NO作為信號分子來研究植物抗逆的報(bào)道較多[10],但對于構(gòu)建不同水平的NO對植物生長發(fā)育及抗逆的研究鮮有報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以黃瓜幼苗為試驗(yàn)材料,通過外源噴施NO供體硝普鈉(SNP)及其清除劑PTIO來構(gòu)建不同NO水平的黃瓜幼苗植株,進(jìn)而研究NO對黃瓜幼苗的生長發(fā)育及低溫脅迫后NO在提高黃瓜幼苗低溫耐受性的機(jī)制,為黃瓜栽培中外源NO供體的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料與處理

        試驗(yàn)材料為‘津研4號’(購自山東祥云種業(yè)有限公司)黃瓜品種,試驗(yàn)所用NO供體SNP購自Sigma公司,試驗(yàn)所用PTIO購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社,草炭購自德國Floragard公司。

        試驗(yàn)材料于2019年3—6月在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站及特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。挑選籽粒飽滿、大小一致的黃瓜種子于55 ℃浸種30 min,自然冷卻至室溫浸泡6 h后于28 ℃恒溫箱內(nèi)黑暗催芽24 h。選取發(fā)芽一致的種子播于72孔穴盤。待兩片子葉完全展開后移入裝有基質(zhì)(V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖=2∶1∶1)的花盆(直徑120 mm,高110 mm),每盆1株,緩苗5 d后每隔4 d澆1次Hoagland營養(yǎng)液(0.5倍),每次100 mL。待幼苗第1片真葉完全展開后,進(jìn)行以下處理:①噴施蒸餾水,每隔1 d噴一次;②噴施200 μmol·L-1SNP,每隔3 d噴1次;③噴施200 μmol·L-1PTIO,每隔1 d噴1次;④噴施200 μmol·L-1PTIO及200 μmol·L-1SNP,PTIO每隔1 d處理1次,SNP每隔4 d處理1次。每處理重復(fù)3次,各15株。

        待植株長至二葉一心后,選取整齊一致的幼苗60株移到人工氣候箱(Percival,美國),10:00對以上植株進(jìn)行低溫處理:晝(14 h)(10±1) ℃、夜(10 h)(6±1) ℃,植物葉片表面受光照強(qiáng)度為100 μmol·m-2·s-1,相對濕度晝75%/夜50%,分別在低溫脅迫0、24和48 h后對植株第2片葉進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

        1.2 測定項(xiàng)目及方法

        1.2.1 植物地上部分干鮮重與葉面積的測量

        黃瓜植株地上部分以子葉下1 cm處為準(zhǔn),稱取植物的鮮重后,將植株放于信封袋內(nèi),置于DCG-9(146 A)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi),105 ℃殺青30 min后,70 ℃烘至恒重,此時(shí)植株的重量記為干重。LI-3100C臺式葉面積儀用于測定植物的葉面積。

        1.2.2 葉綠素含量的測量

        葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素均用丙酮乙醇混合液法進(jìn)行提取[11],日本日立U-3900H紫外分光光度計(jì)用于測量各色素的含量。

        1.2.3 丙二醛含量的測量

        參照Hodges等[12]的方法測定黃瓜葉片丙二醛(MDA)含量。

        1.2.4 過氧化氫含量的測量及過氧化氫染色

        過氧化氫(H2O2)含量的測定采用南京建成生物工程研究所的過氧化氫試劑盒(A064),具體操作使用方法見說明書,H2O2組織化學(xué)染色參考Thordal-Christensen等[13]的方法,雙蒸水沖洗各處理黃瓜幼苗葉片,打孔器(直徑1 cm)打孔,葉圓片放入24孔培養(yǎng)板中,每孔加入1.6 mLDAB反應(yīng)液(50 mmolTris-HCL,pH3.8)用于H2O2染色。300 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下28 ℃光照6 h后將葉圓片放入存有95%無水乙醇中煮沸數(shù)分鐘,肉眼觀察葉片顏色由綠變白后拍照,棕褐色表示H2O2積累程度。

        1.2.5 NO含量及NOS活性測定

        NO含量及NOS活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒(A012-1-2、A0142-2),具體操作使用方法見說明書。

        1.2.6 RNA提取及基因轉(zhuǎn)錄水平

        Trizol法提取黃瓜葉片總RNA,Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific公司,美國)檢測核酸含量瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。Bio-Rad(美國)熒光定量PCR儀用于qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,40個(gè)循環(huán)。以黃瓜的Actin(XM-011659465.1)基因作為內(nèi)參校正并定量分析葉綠素相關(guān)基因、抗冷相關(guān)基因的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量(qRT-PCR)分析:基因表達(dá)的相對定量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算[14]?;虻膓RT-PCR擴(kuò)增引物序列如表所示:

        表1 qRT-PCR引物序列

        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

        采用Excel 2010和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Duncan’s新復(fù)極差法用于差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05),Origin 9.0軟件繪圖。圖表中結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 外源NO處理對黃瓜幼苗生長指標(biāo)的影響

        如表2所示,與CK相比,SNP處理的黃瓜幼苗的葉面積、鮮重及干重分別顯著升高38.55%、45.68%和28.33%;PTIO處理的黃瓜幼苗葉面積、鮮重及干重分別顯著降低了11.70%、6.8%和20.00%;PTIO+SNP處理的黃瓜幼苗葉面積、鮮重分別顯著增加了20.18%、23.53%。此外,與SNP相比,PTIO+SNP處理的黃瓜幼苗的葉面積、鮮重及干重分別顯著降低了13.26%、15.21%和23.38%,說明PTIO抑制了SNP的作用效果。

        表2 不同處理對黃瓜幼苗葉面積、干鮮重的影響

        2.2 外源NO處理對葉綠素含量及其合成基因表達(dá)

        由表3可知,在低溫處理0 h后,與CK相比,SNP處理的葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量分別顯著提高17.85%、21.57%和18.23%;低溫脅迫24 h后,與CK相比,SNP處理的葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量分別顯著提高31.61%、28.81%和33.19%。而PTIO處理與對照相比在0 h時(shí),葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量分別顯著降低16.43%、15.68%和16.67%;在低溫脅迫24 h后,PTIO處理與CK相比,葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量分別顯著降低19.54%、23.73%和19.21%。PTIO+SNP處理的葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量與CK相比無顯著差異。

        表3 低溫脅迫下NO對黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

        如圖1所示,低溫0 h時(shí),與CK相比,SNP和PTIO+SNP處理顯著上調(diào)MgCH和FeCH基因的表達(dá)水平,PTIO處理與CK相比無顯著差異。低溫24 h后,與CK相比,SNP處理的MgCH和FeCH基因的轉(zhuǎn)錄水平依然顯著上調(diào),PTIO處理顯著則抑制FeCH和MgCH基因的表達(dá)水平,PTIO+SNP處理的FeCH基因表達(dá)與CK相比無差異,但MgCH的表達(dá)水平顯著高于CK。

        2.3 外源NO對黃瓜幼苗MDA含量的影響

        如圖2,低溫0 h時(shí),與CK相比,SNP處理的MDA含量顯著降低了12.66%,其他處理與CK相比無顯著差異。低溫24 h后,SNP和PTIO+SNP處理的MDA含量與CK相比無顯著差異,但與CK相比,PTIO處理黃瓜幼苗的MDA含量顯著增加了25.59%。

        圖2 不同NO處理對黃瓜幼苗丙二醛(MDA)含量的影響

        2.4 外源NO對黃瓜幼苗H2O2的影響

        低溫脅迫后黃瓜幼苗H2O2含量的變化如圖3。在低溫0 h時(shí),各處理H2O2含量與CK相比無顯著差異。低溫24 h后,與低溫前相比,各處理的H2O2含量迅速升高,與CK相比,SNP、PTIO處理的H2O2含量顯著增加57.02%、26.47%,PTIO+SNP處理與CK相比無顯著差異。如圖3B,染色深淺與H2O2含量正相關(guān)。H2O2染色圖像與H2O2含量的變化趨勢相一致。

        A—H2O2含量,B—H2O2染色。

        2.5 低溫脅迫下外源NO對黃瓜幼苗內(nèi)源NO及NOS活性的影響

        如圖4所示,低溫脅迫24 h后,與CK相比,SNP和PTIO+SNP處理的NO含量和NOS活性均顯著增加,PTIO處理NO含量與CK相比無顯著差異(圖4A),而與CK相比,PTIO處理的NOS活性顯著降低(圖4B)。

        圖4 低溫脅迫下NO對黃瓜幼苗NO含量和NOS活性的影響

        2.6 外源NO對黃瓜幼苗抗冷相關(guān)基因的影響

        如圖5所示,低溫脅迫后,與CK相比,SNP顯著提高CsWRKR40和CsWRKR57基因的相對表達(dá)水平(除低溫48 h后的CsWRKR40)(圖5 A、5C),顯著降低了CsWRKR53的表達(dá)水平(圖5B),而PTIO處理則表現(xiàn)出與SNP完全相反的作用效果,且PTIO的抑制效果可以被SNP部分恢復(fù)。

        圖5 不同NO處理對黃瓜幼苗抗冷基因表達(dá)的影響

        3 討論

        據(jù)研究[15-16],適宜濃度的NO會(huì)促進(jìn)番茄等植物幼苗的生長。Tian等[17]研究表明濃度適宜的NO處理使豌豆葉片膨大。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SNP處理后黃瓜幼苗的葉面積及干鮮重顯著增加,而PTIO處理則表現(xiàn)出了與SNP相反的作用效果,這與張雙雙等[18]研究的與野生型擬南芥相比,擬南芥NO合成缺陷突變體具有葉色泛黃、葉片較小、植株矮小等結(jié)果一致。這說明本試驗(yàn)利用化學(xué)遺傳法成功構(gòu)建了不同NO水平的黃瓜幼苗植株。Kolbert等[19]研究表明,對NO的nia1、nia2和noa1-2突變體外源施加NO能增加突變體內(nèi)源NO水平,從而提高突變體的抗逆性。本試驗(yàn)證明,低溫脅迫下,外源施加SNP可以顯著提高NO含量和NOS活性,而PTIO對植物內(nèi)源NO和NOS的負(fù)影響可以部分被SNP處理恢復(fù)并提升。

        當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí),光合機(jī)構(gòu)首先受到損傷,葉綠體色素是植物進(jìn)行光合作用的重要基礎(chǔ),葉綠素含量在一定程度上反映了植株進(jìn)行光合作用的能力。低溫會(huì)造成的植物葉綠素的損失[20]。Zhang等[21]研究表明低溫脅迫后,SNP處理會(huì)顯著提高葉綠素的含量和相關(guān)基因表達(dá)。本試驗(yàn)表明,NO顯著提高葉綠素含量及其合成基因FeCH和MgCH的相對表達(dá)水平,而PTIO處理則表現(xiàn)出與SNP相反的作用效果。這表明在低溫脅迫下NO通過提高植物葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平來提高葉綠素含量,進(jìn)而緩解低溫對黃瓜幼苗的傷害。

        MDA是衡量黃瓜低溫耐受性的一個(gè)重要指標(biāo)[22]。吳旭紅等[23]研究表明,外源NO能降低低溫脅迫下植株MDA含量。徐洪雷等[24]研究表明適宜濃度的SNP能夠降低低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性,抑制過氧化作用產(chǎn)物MDA的積累,提高黃瓜幼苗對低溫脅迫的適應(yīng)性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,低溫24 h后SNP處理的MDA含量相比CK而言顯著降低,而PTIO處理則顯著提高了MDA含量。這與徐洪雷等[24]的研究結(jié)果一致。

        植物受到低溫脅迫后,ROS代謝失衡,會(huì)造成ROS如O2-、H2O2、羥自由基(OH·)及單線態(tài)氧等的大量積累[25]。ROS可以傷害蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子引起細(xì)胞氧化損傷,但也可做為信號分子對植物生理進(jìn)行調(diào)節(jié),提高其抗逆性[26]。在非生物脅迫下,H2O2和NO的產(chǎn)生是瞬時(shí)連續(xù)發(fā)生或者平行發(fā)生[27]。Liao等[28]人報(bào)道cPTIO(NO清除劑)可以抑制內(nèi)源性H2O2的生成,說明植物體內(nèi)產(chǎn)生H2O2需要NO的參與。NO和H2O2兩個(gè)分子之間存在相互作用,可以調(diào)節(jié)其他分子、細(xì)胞和整個(gè)植物對各種脅迫的反應(yīng)[27]。Shams等[29]研究發(fā)現(xiàn),NO處理可以提高辣椒體內(nèi)過氧化氫的含量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),正常條件下,NO對黃瓜幼苗過氧化氫含量無顯著影響,在低溫脅迫24 h后,NO誘導(dǎo)H2O2含量顯著上升。這表明NO在低溫脅迫后誘導(dǎo)了黃瓜葉片內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生共同參與到低溫脅迫應(yīng)激反應(yīng)中。

        Ling等[9]研究表明,WRKY轉(zhuǎn)錄因子能響應(yīng)低溫脅迫,至今在黃瓜基因組中共有57個(gè)基因被鑒定為WRKY家族的可能成員,目前已經(jīng)鑒定它們編碼55個(gè)WRKY蛋白(CsWRKY10和CsWRKY16未被鑒定)。在低溫條件下,這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平不盡相同,CsWRKR40和CsWRKR57在低溫下表達(dá)量上調(diào),而CsWKRY53在低溫下表達(dá)量下調(diào)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低溫脅迫后,SNP顯著提高CsWRKR40和CsWRKR57的相對表達(dá)水平(除低溫48 h后的CsWRKR40),抑制CsWRKY53的相對表達(dá)水平,PTIO+SNP處理3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平處于SNP和PTIO處理之間,表明WKRY轉(zhuǎn)錄因子參與了NO增強(qiáng)黃瓜幼苗的耐冷性。

        4 結(jié)論

        正常生長條件下,持續(xù)SNP處理會(huì)誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉面積、干鮮重、葉綠素含量顯著增加。低溫脅迫下,持續(xù)SNP處理,能通過提高NOS的活性、內(nèi)源NO含量、H2O2含量、葉綠素含量和上調(diào)葉綠素合成基因,降低丙二醛含量以及增強(qiáng)與抗冷相關(guān)正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(CsWRKY40和CsWRKY57)的表達(dá)水平,抑制負(fù)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(CsWRKY53)的表達(dá)水平來提高黃瓜幼苗對低溫脅迫的耐受性。

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