焦雨梅，褚鑫，許珂玉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療學(xué)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,遼寧 錦州 121000)

支氣管哮喘是以嗜酸性細(xì)胞浸潤為主，T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞及多種細(xì)胞因子參與的Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，具有氣道高反應(yīng)性及氣道重塑等病理特征。目前研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘的發(fā)生是由于過敏原引起的變態(tài)反應(yīng)促進(jìn)CD4+細(xì)胞向Th2細(xì)胞過度分化，引起Th2因子如：IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等大量分泌，進(jìn)而導(dǎo)致Th2/Th1失衡[1]。Florence Roan等人研究發(fā)現(xiàn)，來自上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如：胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)、IL-33和IL-25等是Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)免疫的中樞調(diào)節(jié)因子,被稱為警報(bào)因子，能有效誘導(dǎo)和激活淋巴細(xì)胞，可能在觸發(fā)整個(gè)過敏性炎癥過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2]。最近的研究數(shù)據(jù)證明，支氣管哮喘病人中Th2細(xì)胞亞群的IL-33和IL-25受體高表達(dá)[3]，進(jìn)一步支持了這些中樞調(diào)節(jié)細(xì)胞因子在加重哮喘免疫過程中的重要作用。本研究旨在以IL-25為研究靶點(diǎn)，探討免疫調(diào)節(jié)劑胸腺肽α1對IL-25水平的影響及相關(guān)機(jī)制，為臨床哮喘治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Wistar大鼠50只，體重(200±20)g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物及試劑 卵清蛋白購自美國Sigma公司，百日咳桿菌、胸腺肽α1、和丙烯酰胺購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)責(zé)任有限公司，兔抗鼠NF-κB和抗β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，蛋白質(zhì)定量試劑盒，DAB二氨基聯(lián)苯顯色試劑盒均購自SantaCruze，Trizol購自Invitrogen，十二烷基苯磺酸鈉(SDS)GenView分裝。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的建立

(1)哮喘模型建立：大鼠分別于第1天和第8天2次致敏，腹腔注射致敏液(含有OVA100 mg，百日咳桿菌5×109，氫氧化鋁200 mg溶于1 mL的生理鹽水中)，1 w后開始用1%OVA霧化進(jìn)行致敏和激發(fā)大鼠，每次持續(xù)30 min，連續(xù)6 w，正常組用生理鹽水代替OVA；(2)分組及給藥：將大鼠隨機(jī)分為5組：正常組為陰性對照組、哮喘模型組為陽性對照組、地塞米松治療組、胸腺肽治療組和地塞米松與胸腺肽聯(lián)合治療組。除正常組外，每只大鼠每次OVA霧化前30 min腹腔注射給藥，哮喘組注射1 mL生理鹽水，地塞米松組按0.5 mg/kg注射地塞米松，胸腺肽治療組按0.5 mg/kg注射胸腺肽，聯(lián)合治療組按0.25 mg/kg地塞米松和胸腺肽0.5 mg/kg分別注射。

1.2.2 肺通氣功能檢測

末次給藥24 h后，測量每組大鼠的呼吸頻率和潮氣量，并計(jì)算每分鐘通氣量。

1.2.3 ELISA檢測大鼠肺泡灌洗液(BALF)及血清IL-25及IL-5水平測定

末次給藥24 h后取大鼠外周血2 mL，離心后取血清待測，然后2%戊巴比妥鈉，以40 mg/kg腹腔注射麻醉，無菌操作開胸暴露氣管，進(jìn)行插管，無菌注射器注入5 mL生理鹽水，灌洗3次，回收的灌洗液3 mL，4 ℃，1500 r離心10 min，回收上清置于-20 ℃等待進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。按照ELISA試劑盒嚴(yán)格操作，分別檢測血清IL-25及IL-5的含量。

1.2.4 Western blot 測定各組大鼠NF-κB的表達(dá)

取大鼠肺組織，加入細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH為7.5，1 mmol/L EDTA，0.15 mmol/L NaCl，0.5%Triton X-100)制備組織勻漿，4 ℃離心12 000 rpm，15 min，分離上清提取總蛋白，Bradford法測上清液的蛋白含量，以β-actin的表達(dá)水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，取60 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用封膜液(5%脫脂奶，含0.05%的TWeen20磷酸緩沖液)室溫封閉30 min，漂洗3次，每次10 min，加入β-actin和兔抗鼠的NF-κB多克隆抗體1∶1000稀釋，4 ℃孵育過夜，再次漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶5000稀釋，37 ℃搖床室育2 h，再次漂洗3次，DAB顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)系統(tǒng)對目的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 肺通氣功能檢測

見表1。

表1 各組大鼠的肺通氣功能比較

2.2 血清及肺泡灌洗液IL-25及IL-5的水平

見表2、表3。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液IL-25、IL-5的濃度的比較

表3 各組大鼠血清IL-25、IL-5的濃度比較

2.3 各組肺組織NF-κB的表達(dá)水平

Western bloting測定各組大鼠NF-κB的表達(dá)，以β-actin做對照進(jìn)行定量測定，見表4，見圖1。

注：A正常組；B哮喘組；C地塞米松治療組；D胸腺肽組；E聯(lián)合用藥組；β-actin為細(xì)胞蛋白表達(dá)水平內(nèi)參對照

表4 各組大鼠NF-κB的表達(dá)水平比較

2.4 NF-κB的表達(dá)與IL-25的濃度的相關(guān)性

見表5。

表5 NF-κB的表達(dá)與IL-25表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

支氣管哮喘是一種以可逆性氣流受限、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)為特征的慢性氣道疾病，而Ⅱ型免疫反應(yīng)(包括Ⅱ型輔助T細(xì)胞、Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等細(xì)胞的反應(yīng))在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，關(guān)于哮喘發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制目前認(rèn)為變態(tài)反應(yīng)引起的Th1/Th2失衡是其發(fā)病的主要原因。Florence Roan等人研究認(rèn)為，IL-25作為IL-17細(xì)胞因子家族的一員，其受體包含IL-17RA(信號(hào)亞單位)和IL-17RB(特異性分子結(jié)合亞單位)兩個(gè)亞單位，能夠通過多種機(jī)制直接活化嗜酸粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)，導(dǎo)致EOS浸潤引起哮喘發(fā)生[2-3]462-469，639-648。Du W等人也有類似研究，發(fā)現(xiàn)哮喘患者成熟EOS表面IL-17RA和IL-17RB表達(dá)水平以及血漿IL-25水平均比非哮喘人群顯著升高，而在吸入過敏原激發(fā)后，哮喘患者血漿和EOS胞內(nèi)IL-25水平、EOS表面IL-17RA/RB及IL-17RB受體水平均顯著升高。在OVA致敏和激發(fā)小鼠中，敲除IL-25顯著減輕了OVA誘導(dǎo)的氣道EOS細(xì)胞浸潤，肺泡灌洗液中EOS和肺組織中新生的EOS均明顯減少，說明了IL-25在哮喘發(fā)生病理過程中起了至關(guān)重要的作用[4-5]。

胸腺肽α1是由28個(gè)氨基酸組成的短肽，是臨床常用的免疫調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體細(xì)胞免疫功能的作用。目前關(guān)于胸腺肽治療支氣管哮喘鮮有報(bào)道，本文旨在探討胸腺肽α1對IL-25及Th2因子IL-5水平的影響及可能的相關(guān)機(jī)制。研究結(jié)果顯示哮喘組BALF和血清中的IL-25及IL-5水平均高于正常組，且具有差異顯著(P<0.01)，與哮喘組比較，經(jīng)地塞米松、胸腺肽α1及聯(lián)合治療后IL-25及IL-5表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，且聯(lián)合用藥效果與地塞米松沒有顯著性差異，推測胸腺肽α1治療哮喘可能通過降低IL-25與IL-5表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。

NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞胞漿的多效能的轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下NF-κB與其抑制物結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性。NF-κB可受氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子或前炎癥因子等多種刺激而活化，通過與多種基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)的特異結(jié)合促進(jìn)基因表達(dá)。本研究為了進(jìn)一步探索可能發(fā)生的機(jī)制[6]，實(shí)驗(yàn)中利用Western blot檢測實(shí)驗(yàn)各組中NF-κB的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，哮喘組NF-κB的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，胸腺肽α1治療組、地塞米松組和聯(lián)合用藥組與哮喘組比較表達(dá)水平均明顯下降(P<0.01)，聯(lián)合用藥組與地塞米松治療組比較差異不顯著，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為了進(jìn)一步了解他們之間相關(guān)性，進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)線性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示肺泡灌洗液和血清中IL-25與IL-5表達(dá)水平，二者高度正相關(guān)(r=0.97，r=0.93，P<0.01)，推測IL-5的表達(dá)可能依賴IL-25表達(dá)，哮喘變態(tài)反應(yīng)IL-25作為中樞調(diào)節(jié)因子與受體結(jié)合后促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)IL-5表達(dá)的結(jié)果，為了進(jìn)一步分析IL-25與NF-κB表達(dá)水平的相關(guān)性，分別對其表達(dá)結(jié)果做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示IL-25與NF-κB表達(dá)水平成高度正相關(guān)(r=0.96，P<0.01)，推測IL-25表達(dá)水平均與NF-κB的表達(dá)密切相關(guān)，是否通過IL-25與其受體結(jié)合激活NF-κB進(jìn)而促進(jìn)IL-5的表達(dá)有待于進(jìn)一步深入研究。

臨床上哮喘患者通常反復(fù)發(fā)作，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療哮喘會(huì)常常會(huì)帶來很多副作用，如骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、血糖增高等，能探索取代或減少激素用量的有效藥物，對臨床治療有重要意義。

從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，胸腺肽α1與地塞米松聯(lián)合用藥可減少地塞米松的用量，且治療效果與單純應(yīng)用地塞米松沒有顯著差異，可作為臨床治療哮喘的輔助免疫調(diào)節(jié)劑，為臨床哮喘的治療提供了實(shí)驗(yàn)性依據(jù)和參考價(jià)值。