沈曉穎，楊寧，高瑜，單偉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.山東青島市黃島區(qū)人民醫(yī)院，山東 青島 266000；4.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，遼寧 錦州 121000)

II型糖尿病(T2DM)是全球最常見的慢性疾病之一，常常會(huì)引起大血管和微血管并發(fā)癥[1]。在T2DM治療上，目前仍然是以改善高血糖水平以及提高目標(biāo)組織中胰島素反應(yīng)為目標(biāo)。此外，由于大多數(shù)患者治療依從性較低，很多患者血糖控制的不好[2]。肥胖抑制素(OB)是一種有爭議的腸道激素。它是由23氨基酸組成的多肽，由編碼饑餓素(Ghrelin)的同一基因編碼。因?yàn)樗鼘?duì)食物的攝取有抑制作用，故此命名為肥胖抑制素[3]。肥胖抑制素最初是從老鼠的胃中分離并提取出來，后來，在胰腺中也發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生肥胖抑制素的細(xì)胞。肥胖抑制素多表達(dá)在胎兒、新生兒和成人胰腺中，在胰腺發(fā)生發(fā)育和維持體內(nèi)平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。 通過對(duì)肥胖小鼠的血液中的肥胖抑制素的研究，發(fā)現(xiàn)其濃度水平較正常小鼠降低，這表明低濃度的肥胖抑制素可能通過自分泌/旁分泌機(jī)制影響胰腺[5]。此外，體外研究表明肥胖抑制素可增強(qiáng)胰島β樣細(xì)胞功能，這為我們采用新的細(xì)胞替代療法策略治療糖尿病提供了思路。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是具有多向分化潛能成體干細(xì)胞中的一種，能夠?qū)κ軗p組織進(jìn)行微環(huán)境改造，通過抗炎和抗凋亡介質(zhì)促進(jìn)組織再生和修復(fù)[6]。因此，本研究觀察MSCs聯(lián)合OB對(duì)T2DM小鼠胰腺β細(xì)胞內(nèi)分泌功能損傷的治療潛力。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只昆明小鼠，體重40～50 g，雄性，在恒溫恒濕環(huán)境的動(dòng)物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，定期更換墊料以及消毒環(huán)境。允許自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 主要試劑

兔抗CD105、 Bax、insulin抗體、購于北京博奧森生物技術(shù)公司。胰島素和血清C肽ELISA試劑盒購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。STZ、肥胖抑制素購于Sigma-Aldrich化學(xué)公司。低糖DMEM/F12，MEM培養(yǎng)基、FBS、GFP質(zhì)粒、Lipofectamine2000、MTT購于Gibco-Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BM-MSCs細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及GFP標(biāo)記

用含有2 mL EDTA的 PBS從小鼠脛骨中沖出骨髓細(xì)胞。用15 mL的Ficoll-Paque分離液對(duì)35 mL的稀釋細(xì)胞小心地進(jìn)行分層，以400 ×g速度進(jìn)行離心30 min，丟掉上清層，留下中間單核細(xì)胞(MNC)層。吸出MNC層，在PBS中洗2次，并在900×g轉(zhuǎn)速下離心10 min。用300 μL的緩沖液重新懸浮細(xì)胞。分離的MSCs在25 mL的培養(yǎng)瓶中采用MEM培養(yǎng)基(15%的胎兒牛血清)，并在37 ℃和5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29和CD90。

當(dāng)MSCs生長到對(duì)數(shù)生長期時(shí)，細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中過夜。當(dāng)達(dá)到30%～50%壁率時(shí)，將GFP表達(dá)載體質(zhì)粒2 μg和脂質(zhì)體2 mL分別溶于100 mL無抗生素、無血清的MEM培養(yǎng)基中，充分混勻后，室溫放置15 min，再將兩種溶液充分混勻，室溫放置30 min。同時(shí)用無血清、無抗生素的MEM洗滌待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞2～3次，向DNA-脂質(zhì)體混合物中加入800 mL無抗生素、無血清的MEM培養(yǎng)基，混合后加入到培養(yǎng)細(xì)胞中。培養(yǎng)皿放入37 ℃孵箱孵育6～8 h后吸去雙無培養(yǎng)液，加入2～3 mL含抗生素和10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記MSCs細(xì)胞熒光情況。

1.2.2 T2DM模型制備與實(shí)驗(yàn)分組

給予動(dòng)物高脂飲食(HFD)飼養(yǎng)8 w，通過腹腔注射給予小鼠單次低劑量的STZ(30 mg/kg)。經(jīng)過5 d的STZ注射后，通過血糖儀檢測(cè)葡萄糖。當(dāng)葡萄糖水平超過160 mg/dL的小鼠確認(rèn)為糖尿病模型成功。實(shí)驗(yàn)分為5組，每組動(dòng)物10只：

I組(對(duì)照組)：小鼠正常飲食飼養(yǎng)8 w，不給予任何干預(yù)措施；II組(T2DM)：T2DM小鼠，不接受治療；III組(T2DM+MSCs)：T2DM小鼠給予MSCs移植治療，連續(xù)2次(2×106)首次在1 w后通過尾靜脈注射，第2次是在3 w后注射；IV組(T2DM+OB)：T2DM小鼠按照100 μg/kg濃度1天2次通過皮下注射OB；V組(T2DM+MSCs+OB)：T2DM小鼠MSCs聯(lián)合OB治療。

1.2.3 血液樣本和組織收集

胸骨左側(cè)做一橫切口，暴露肋骨。在第五和第六肋骨之間用彎鉗擴(kuò)大間隙，暴露心臟，從右心室抽取血液樣本。繼續(xù)切開腹膜暴露胰腺并切除，胰腺組織10%福爾馬林液固定，行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。

1.2.4 肥胖評(píng)估與生化檢測(cè)

每周記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重。長度采用鼻尖-肛門的長度為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。通過肥胖參數(shù)身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(BMI = 體重/長度的平方，g/cm2)確定肥胖程度?？崭寡峭ㄟ^葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法進(jìn)行檢測(cè)。而空腹血清胰島素水、C肽血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)采用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估

抗胰島素性穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估計(jì)算方程為HOMA-IR = 胰島素(μIU/mL)×葡萄糖(mmol/L)。β細(xì)胞功能體內(nèi)穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估測(cè)量公式為HOMA-β = 20×胰島素(μIU/mL)/(葡萄糖)(mmol/L)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及形態(tài)學(xué)定量分析

胰腺組織石蠟包埋，5 μm切片，0.3%的過氧化氫阻止內(nèi)源性過氧化物酶活性。5%的牛血清白蛋白減少非特異性結(jié)合。分別滴加兔抗CD105抗體、兔抗Bax抗體、兔抗insulin抗體孵育1 h，然后加入HRP標(biāo)記的二抗。DAB顯色并適時(shí)終止顯色。胰島素和Bax免疫組化表達(dá)的定量分析采用隨機(jī)選取5個(gè)非重疊區(qū)域的5張圖片進(jìn)行量化，用圖像分析軟件計(jì)算區(qū)域內(nèi)陽性細(xì)胞的平均百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

2 結(jié) 果

2.1 MSCs和OB對(duì)T2DM小鼠體重、BMI、血糖、胰島素、C肽、HOMA-IR和HOMA-β的影響

T2DM組與對(duì)照組相比，體重、體重指數(shù)、血清葡萄糖和HOMA-IR水平顯著升高(P<0.05)，而胰島素、C肽和HOMA-β水平顯著降低(P<0.05)。MSCs治療組與T2DM組相比，血清葡萄糖和HOMA-IR明顯下降(P<0.05)，同時(shí)血清胰島素、C肽和HOMA -β明顯增加(P<0.05)。然而，在體重和BMI方面MSCs治療組未能產(chǎn)生顯著影響。另一方面，OB治療組(IV組)較T2DM組動(dòng)物在體重、體重指數(shù)、血清葡萄糖和HOMA-IR參數(shù)上明顯降低(P<0.05)，同時(shí)胰島素、C肽和HOMA-β水平顯著增加(P<0.05)。MSCs與OB聯(lián)合應(yīng)用組(V組)以上各參數(shù)均達(dá)到控制水平。另外，IV組較III組動(dòng)物在體重、BMI、血糖、HOMA-IR上有降低(P<0.05)，同時(shí)HOMA -β有明顯增加，P<0.05，見表1。

表1 各組動(dòng)物體重、BMI、血清葡萄糖、胰島素、C肽、HOMA-IR和HOMA-β水平

2.2 MSCs和OB對(duì)T2DM小鼠血脂的影響

與對(duì)照組相比，給予高脂飲食(HFD)和STZ處理(II組)的動(dòng)物TC、TG、LDL水平顯著升高(P<0.05)，而 HDL顯著降低(P<0.05)。與T2DM組相比，給予MSCs或OB治療后的動(dòng)物血清TC、TG和LDL均顯著降低(P<0.05)，而HDL顯著升高(P<0.05)。另一方面，V組(T2DM+MSCs+ob)的脂質(zhì)水平接近于控制水平。與III(T2DM+MSCs) 相比，IV組(T2DM+ob)TC、TG、LDL水平顯著降低(P<0.05)，這表明OB較MSCs具有更好的保護(hù)作用，見表2。

表2 不同動(dòng)物組的脂質(zhì)分布水平

2.3 免疫化學(xué)結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：治療組胰腺組織中CD105表達(dá)陽性，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈褐色染色。表明移植的MSCs的存活了下來，見圖1A。CD105陽性細(xì)胞分布在正常胰島周圍的邊緣部位，有的甚至定位在β細(xì)胞上，見圖1A。胰腺組織中GFP的表達(dá)陽性，顯示細(xì)胞活力良好，見圖1B。

A：移植MSCs中CD105的表達(dá)；B：移植MSCs中GFP的表達(dá)，400倍

2.3.1 胰島素免疫組織化學(xué)染色

I組可見移植小鼠的胰腺胰島β細(xì)胞呈強(qiáng)陽性染色，可見明顯的分泌顆粒，見圖2A；而II組小鼠的胰腺胰島β細(xì)胞顯示的分泌顆粒染色強(qiáng)度有所減弱，見圖2B；然而，III組小鼠的胰腺β細(xì)胞染色強(qiáng)度較與組II相比又有所回升，見圖2C；IV組與II組比較胰島β細(xì)胞染色強(qiáng)度也相對(duì)有所回升，見圖2D；另外，V組較II組胰島β細(xì)胞染色強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，見圖2E。

A：I組小鼠胰島β細(xì)胞分泌顆粒染色強(qiáng)陽性；B：II組胰島β細(xì)胞分泌顆粒染色呈弱陽性；C：III組小鼠胰島β細(xì)胞分泌顆粒染色中等強(qiáng)度；D：IV組胰島β細(xì)胞分泌顆粒呈中等強(qiáng)度；E：V組胰島β細(xì)胞分泌顆粒染色呈強(qiáng)陽性，400倍

2.3.2 Bax免疫組織化學(xué)染色

I組小鼠胰島細(xì)胞Bax免疫染色呈陰性，見圖3A；II組胰島細(xì)胞Bax免疫染色呈高表達(dá)，提示小鼠細(xì)胞凋亡率增高，見圖3B；III組小鼠胰島切片顯示胰島Bax免疫染色呈弱陽性，見圖3C；同時(shí)，第IV組小鼠胰腺切片顯示胰島Bax免疫染色呈弱陽性，見圖3D；最后，V組小鼠胰腺切片上胰島細(xì)胞Bax表達(dá)最低，見圖3E。

2.4 圖像測(cè)量結(jié)果

各組胰島素免疫染色的平均面積百分比見表3。與I組比，II組胰島素免疫染色平均面積百分比有明顯降低(P<0.05)，而治療組(III組和V組)較II組胰島素免疫染色平均面積百分比有顯著增加(P<0.05)。此外，V組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，表3顯示Bax免疫染色的平均面積百分比。與對(duì)照組相比II組面積有顯著增加(P<0.05)，而III組和IV組表達(dá)平均面積百分比較組II有明顯降低(P<0.05)。V組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組動(dòng)物胰島素和Bax免疫染色平均面積百分比(%)

A：I組小鼠β細(xì)胞組織化學(xué)染色陰性；B：II組胰島Bax免疫染色呈強(qiáng)陽性；C：III組小鼠胰島Bax免疫染色呈弱陽性；D：IV組小鼠胰島Bax免疫染色呈弱陽性；E：V組胰島Bax免疫染色低表達(dá)，400倍

3 討 論

在本研究中，經(jīng)高脂飼養(yǎng)8 w聯(lián)合STZ注射導(dǎo)致動(dòng)物體重指數(shù)顯著增加，而HOMA-IR的增加則表明血清葡萄糖的胰島素抵抗增強(qiáng)，HOMA -β的降低表明了胰腺胰島素顯著減少和β細(xì)胞功能的下降。本研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠血清C肽水平降低。血清C肽水平是胰島素水平變化的真實(shí)指標(biāo)，因?yàn)樗且葝u素原酶降解成胰島素的副產(chǎn)物，與胰島素共同分泌。免疫組化顯示胰島素染色強(qiáng)度降低。表明HFD聯(lián)合STZ可誘導(dǎo)T2DM小鼠模型發(fā)生進(jìn)展性的β細(xì)胞功能障礙。Song等[6]468-475研究也認(rèn)為STZ給藥后，胰腺組織出現(xiàn)退行性組織學(xué)改變和胰島萎縮，B細(xì)胞的胰島素反應(yīng)變?nèi)酢Ｋ麄冋J(rèn)為STZ通過產(chǎn)生活性氧、激活胰腺NF-κB和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥等幾種機(jī)制破壞胰島細(xì)胞。

目前的研究顯示，通過MSCs移植控制了胰島損傷，表現(xiàn)為葡萄糖，胰島素抵抗，血清胰島素、C肽、β細(xì)胞功能有了顯著改善。這些結(jié)果與Mansor等人[7]的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為MSCs具有組織修復(fù)和細(xì)胞保護(hù)的特性，這可能是由于MSCs對(duì)損傷胰腺組織具有優(yōu)先歸巢的特性，而且胰島重建效果顯著。此外，MSCs治療顯著提高胰島素敏感性以及降低胰島素抵抗。這些結(jié)果表明，MSCs可以通過調(diào)節(jié)外周靶組織的胰島素敏感性來降低高血糖[8]。

MSCs通過使胰島組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)從而改善了糖尿病的指標(biāo)。III組結(jié)果顯示胰島素的免疫反應(yīng)活性增強(qiáng)以及胰島Bax反應(yīng)的降低，這也從另一個(gè)角度說明了MSCs的對(duì)糖尿病的改善作用。另一方面，給予OB后，體重指數(shù)、血清葡萄糖、胰島素抵抗明顯降低，而血清胰島素、C肽水平、胰腺組織β細(xì)胞功能顯著增加。通過HE染色發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胰島組織結(jié)構(gòu)改善、胰島素免疫反應(yīng)活性增加和胰島Bax反應(yīng)降低，這3個(gè)方面都證明了OB的改善作用。

Shamaony等[9]針對(duì)糖尿病小鼠血脂異常高的現(xiàn)象，指出了胰島素抵抗會(huì)促進(jìn)膽固醇的生成。血清LDL-C水平的升高可能是LDL-C非酶糖基化的結(jié)果，也可能是LDL-C清除率降低的結(jié)果。在本研究中，MSCs對(duì)糖尿病小鼠的治療使血脂表達(dá)正常。這個(gè)結(jié)果與Ahmed[10]等人的一致，他們認(rèn)為血脂的改善是因?yàn)镸SCs改善了胰島β細(xì)胞功能，并降低胰島素抵抗。另一方面，本研究中給予OB后顯著改善了血脂情況。Granata等[11]對(duì)TG和TC降低給出了另一種解釋，他們認(rèn)為可能是由于OB對(duì)腸道TG的吸收產(chǎn)生了影響。此外，OB可以通過刺激脂肪酸的攝取和抑制其釋放或脂解，參與到食物攝入和能量穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過程。

此外，與未接受治療的糖尿病小鼠相比，接受OB治療的糖尿病小鼠的BMI明顯下降。Baragli等[12]研究表明，在服用了OB的肥胖小鼠體重指數(shù)下降，認(rèn)為其食物攝入量的減少和產(chǎn)生厭食癥的作用。通過比較OB和MSCs治療的效果，發(fā)現(xiàn)OB在體重、體重指數(shù)、血清葡萄糖、TC、TG、LDL、HOMA-IR和HOMA-β 等方面有優(yōu)越的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用可能是與OB的厭食作用和食物攝入量的減少作用有關(guān)。