張子赟 何欣樾 王明皓 石娟 張?zhí)靾? 周家旺 高楠 馬超

摘 要：為探究城市生活垃圾堆放對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，通過擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，對(duì)垃圾堆放處表層深度20cm的土壤（處理組）和距離垃圾堆放處5m以外同樣深度的土壤（對(duì)照組）細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析及功能預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：對(duì)照組和處理組分別得到55935和47812條有效序列;相較于對(duì)照組，處理組的土壤細(xì)菌豐富度（chao1）降低24.06%，細(xì)菌多樣性（shannon）降低17.84%;在細(xì)菌門分類水平上，2組土壤的優(yōu)勢(shì)門類均為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），但相對(duì)豐度具有顯著差異，其中處理組厚壁菌門相對(duì)于對(duì)照組增加43.68%，綠彎菌門減少8.58%;優(yōu)勢(shì)屬類為芽孢桿菌屬（Bacillus）、虛構(gòu)芽孢桿菌屬（Fictibacillus），其中芽孢桿菌屬相對(duì)豐度最高，處理組相對(duì)于對(duì)照組增加26.56%;PICRUSt預(yù)測(cè)結(jié)果表明，6個(gè)代謝通路中有46個(gè)KEGG二級(jí)功能群，其中碳水化合物代謝為2組樣品在二級(jí)功能群的優(yōu)勢(shì)功能，有垃圾覆蓋對(duì)功能基因豐度及多樣性影響不顯著。由此可見，垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌豐度和多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響，對(duì)細(xì)菌群落的相對(duì)豐度具有顯著影響，對(duì)功能無明顯影響，此結(jié)果闡明了優(yōu)化垃圾處理方法的重要性。

關(guān)鍵詞：生活垃圾;土壤微生物;16S rRNA測(cè)序;PICRUSt功能預(yù)測(cè);合肥方興社區(qū)

中圖分類號(hào) S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）20-0123-05

Influence of Municipal Solid Waste Stacking on Soil Bacterial Community Structure and Function

ZHANG Ziyun1 et al.

（1Anhui Province Key Lab of Farmland Ecological Conservation and Pollution Prevention，School of Resources and Environment，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Abstract： To explore the influence of municipal solid waste stacking（MSWS）on the soil microorganism，the soil bacterial community structure and function of soil sampled from the garbage dump（treatment）and soil sampled from the palce 5m away from the garbage dump（control）was analyzed by 16srRNA sequencing and PICRUSt. The results showed that： compared with the control， the soil bacteria richness（chao1）in the treatment group decreased by 24.06%， and the bacteria diversity（Shannon）decreased by 17.84%. The dominant soil microbial communities at the phylum level were Proteobacteria，Chloroflexi， Acidobacteria and Actinobacteria，but their relative abundance was significantly different. Compared with the control， Firmicutesand Chloroflexiof treatment was increased by 43.68% anddecreased by 8.58%，respectively. The dominant genera were Bacillus and Fictibacillus，while the Bacillus occupied the hightest species richness. Compared with the control， Bacilluswas increased by 26.56%.PICRUSt analysis demonstrated that there were 46 subfunctional groups from 6 metabolic pathways were determined in the soil bacterial gene sequences. Among these functions， carbohydrate metabolism was the main metabolic function groups in the bacterial communities，and garbage coverage had no significant influence on the abundance and diversity of functional genes. In conclusion，garbage stacking had significant negative effect on the abundance and diversity of soil bacteria community，but had no effect on their function.

Key words： Domestic garbage;Soil microorganism; 16S rRNA sequencing; PICRUSt function prediction; Fangxing community in Hefei

隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展、城市化進(jìn)程的加快，城市生活垃圾產(chǎn)生量迅速增長(zhǎng)，垃圾處理工作壓力持續(xù)增加。安徽省16市城鎮(zhèn)每天生活垃圾產(chǎn)生量為27130.3t，其中以合肥市每天產(chǎn)生的生活垃圾最多，可達(dá)5302t[1]。目前，合肥市處理垃圾的方法比較單一，多為填埋或直接堆放，堆放過程中會(huì)產(chǎn)生含有大量有機(jī)物、氨氮元素、重金屬離子、漂浮物和致病細(xì)菌的滲濾液，通過雨水沖刷對(duì)土壤造成污染[2]。因此，研究生活垃圾堆放下土壤細(xì)菌的組成和多樣性，對(duì)改善生活垃圾處理方式、減少垃圾堆放引起的環(huán)境污染具有重要意義。

早期生活垃圾堆放對(duì)土壤的影響研究主要關(guān)注土壤理化性狀和重金屬含量[3，4]。例如，席北斗等[3]研究證明生活垃圾長(zhǎng)期堆放導(dǎo)致周邊土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，距離堆體最近處土壤硝化速率和呼吸速率明顯提高;李永霞等[4]通過研究山東省某近郊生活垃圾土壤，發(fā)現(xiàn)堆體下土壤重金屬含量高。也有少數(shù)學(xué)者研究了生活垃圾堆放對(duì)土壤微生物性狀的影響。例如，謝冰等[5]利用PCR-DGGE技術(shù)研究東北地區(qū)垃圾堆放對(duì)不同深度土壤微生物多樣性的影響，結(jié)果表明土壤深層的微生物多樣性高于土壤表層。然而，由于前期土壤微生物性狀分析技術(shù)的限制，生活垃圾堆放對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響一直沒有得到系統(tǒng)和完備的解析[6]。隨著高通量測(cè)序的不斷發(fā)展，利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，不僅可以準(zhǔn)確分析土壤微生物群落的組成狀況，還可以對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[7]。因此，利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)探究生活垃圾堆放對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響十分必要。筆者通過采集生活垃圾覆蓋下的土壤，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行菌落結(jié)構(gòu)分析以及功能性預(yù)測(cè)，研究土壤細(xì)菌的組成和多樣性，并將之與相鄰未堆放垃圾處的土壤微生物群落組成和功能進(jìn)行比較，以期闡明生活垃圾覆蓋對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為生活垃圾的合理處置和垃圾污染土壤的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況 采樣地點(diǎn)位于安徽省合肥市方興社區(qū)，合肥市濱湖新區(qū)的核心區(qū)域，轄區(qū)面積11.8km2，規(guī)劃人口30萬。區(qū)域?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，年均氣溫15.7℃，年降水量約為1000mm，年日照時(shí)數(shù)約2000h，年平均無霜期228d，平均相對(duì)濕度77%;供試土壤類型為黃棕壤。

1.2 樣品采集 在方興社區(qū)生活垃圾堆放密集位置，按照5點(diǎn)采樣法選擇5個(gè)10cm×10cm規(guī)格的樣方，除去土壤表面雜草、枯葉和表層土，取距離表層約20cm處的土塊，將5個(gè)土樣混合均勻取1kg裝入無菌自封袋，作為處理組（T）;同時(shí)在垃圾堆周圍5m處，隨機(jī)采集5點(diǎn)未堆放垃圾的0～20cm處土壤混合留存1kg裝入無菌自封袋，作為對(duì)照組（C）。2組土壤放入低溫保溫箱帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行除雜和過篩處理，然后置于-80℃冰箱中備用。

1.3 土壤總DNA的提取和高通量測(cè)序、分析 按照Fast DNA? Spin Kit for Soil（MP Biomedicals，U.S.A）試劑盒提供的方法提取土壤總DNA。土壤基因組DNA經(jīng)凝膠電泳和NanoDrop2000測(cè)試質(zhì)量合格后，利用引物序列515F（5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3）、806R（5- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）對(duì)16S rRNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為47℃[8]。將PCR擴(kuò)增得到了DNA產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，取1μL體積的DNA產(chǎn)物于電泳槽內(nèi)加入相應(yīng)的marker進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為300bp左右的DNA條帶，選擇此條帶進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 測(cè)序數(shù)據(jù)采用雙端數(shù)據(jù)fastq保存，使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，截去Barcode和引物序列后使用FLASH軟件進(jìn)行拼接、過濾、去除嵌合體序列[9]，得到有效數(shù)據(jù);使用UPARSE軟件（v7.0.1090）根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，根據(jù)OTU列表中的各樣品物種豐度情況，應(yīng)用軟件Mothur（v.1.30.2），計(jì)算種群豐富度指數(shù)Chao和ACE和群落多樣性指數(shù) Shannon 和 Simpson;采用RDP classifier貝葉斯算法[10]對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析將優(yōu)化序列根據(jù)silva庫(kù)中的參考序列對(duì)OTU進(jìn)行種屬鑒定[11]。利用R軟件在門（phylum）和屬（genus）的水平上作樣品群落分布柱狀圖。使用PICRUSt（v2.0.0）軟件進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)，根據(jù)功能分類豐度，繪制功能豐度熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果 對(duì)無生活垃圾覆蓋（C）和有生活垃圾覆蓋（T）處理的土壤細(xì)菌16S rRNA基因序列的V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，分別得到71759和75052條序列，在剔除引物、低質(zhì)量序列后，分別得到55935和47812條有效序列。對(duì)有效序列基于97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，處理組和對(duì)照組一共得到1153個(gè)有效的OTU，分別為831和1102個(gè);在門水平得到33個(gè)分類單元，2個(gè)處理分別為24和32個(gè);在屬水平得到373個(gè)分類單元，2個(gè)處理分別為299和351個(gè)。

2.2 土壤細(xì)菌多樣性 2個(gè)處理的土壤細(xì)菌Alpha多樣性結(jié)果見表1。由表1可知，處理組的Chao1和ACE指數(shù)均比對(duì)照組低24.06%和20.72%，無生活垃圾覆蓋的土壤細(xì)菌具有更高的豐富度;處理組的shannon指數(shù)低于對(duì)照組17.84%，而simpson指數(shù)高于對(duì)照組，沒有生活垃圾覆蓋的土壤物種多樣性更高。2組樣本的測(cè)序覆蓋率均在 99%以上，說明取樣合理，測(cè)序數(shù)據(jù)能夠真實(shí)反映土壤樣品中的微生物群落。

2.3 土壤細(xì)菌組成 土壤細(xì)菌群落組成分析結(jié)果表明：在門水平，處理組與對(duì)照組的土壤細(xì)菌組成非常相似，相對(duì)豐度均以厚壁菌門（Firmicutes）為最高，在2處理中分別為68.42%和24.73%，其次依次為變形菌門（Proteobacteria）（9.84%、16.20%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（2.85%、11.43%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（7.09%、6.81%）、放線菌門（Actinobacteria）（4.80%、6.95%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（0.81%、9.30%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.54%、2.69%）、浮霉菌門（Planctomycetes）（0.84%、2.35%）、匿桿菌門（Latescibacteria）（0.25%、1.88%）和GAL 15（0.04%、4.69%）（圖1）。相較于對(duì)照組，處理組中厚壁菌門和酸桿菌門的相對(duì)豐度增加，其中厚壁菌門增加幅度最大，為43.68%;而變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、芽單胞菌門等相對(duì)豐度減少，其中綠彎菌門減少幅度最大，為8.58%。

在屬水平上，2組處理均以芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度最高，分別為37.05%和10.50%（圖2）。相較于對(duì)照組，處理組中芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、膨脹芽孢桿菌屬（Tumebacillus）、未分類的動(dòng)球菌科的相對(duì)豐度增加，分別增加26.56%、1.74%、1.43%、3.34%;Rokubacteriales、厭氧繩菌科、虛構(gòu)芽孢桿菌屬（Fictibacillus）、MND1、Ramlibacter、溶桿菌屬（Lysobacter）的相對(duì)豐度減少，分別減少3.53%、1.91%、1.50%、3.38%、1.60%和1.15%。

通過Venn圖分析2個(gè)處理土壤細(xì)菌共有的屬數(shù)量及特有的屬數(shù)量，共有的屬數(shù)量有277個(gè)，對(duì)照組特有的屬數(shù)量有74個(gè)，處理組特有的屬數(shù)量有22個(gè)（圖3）。其中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鐵氧化屬（Sideroxydans）、Desulfosporosinus為對(duì)照組特有的菌屬。尿素芽孢桿菌屬（Ureibacillus）、Planktosalinus、漠河桿菌屬（Moheibacter）、Ferruginibacter等為處理組特有的菌屬。

2.4 土壤的細(xì)菌功能性預(yù)測(cè) 通過對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）進(jìn)行比對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在KEGG一級(jí)功能層中有6個(gè)代謝通路：細(xì)胞過程（Cellular processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、人類疾?。℉uman Diseases）、代謝（Metabolism）、有機(jī)體系統(tǒng)（Organismal Systems），其中代謝功能的占比最高，處理組中達(dá)到了68.21%，對(duì)照組為68.36%。在基因二級(jí)功能預(yù)測(cè)分析中發(fā)現(xiàn)由碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、能量代謝（Energy metabolism）、輔助因子和維生素的代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、全局和概覽地圖（Global and overview maps）、膜運(yùn)輸（Membrane transport）、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）、信號(hào)傳導(dǎo)（Signal transduction）、類脂化合物代謝（Lipid metabolism）等46個(gè)子功能組成（圖4）。相較于對(duì)照組，處理組中的碳水化合物代謝、膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、耐藥性等功能增強(qiáng)，相對(duì)豐度分別升高1.11%、0.9%、0.4%、0.07%;氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他次生代謝物的生物合成、多糖的生物合成和代謝等功能有所降低，相對(duì)豐度分別降低0.19%、0.15%、0.31%、0.25%、0.25%。基因三級(jí)功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)有15條碳水化合物代謝途徑，包括丙酮酸代謝、糖酵解、氨基酸和核苷酸代謝、乙醛酸代謝、淀粉和蔗糖的代謝、檸檬酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等。相對(duì)于對(duì)照組，處理組中淀粉和蔗糖的代謝增加幅度最大，為0.28%。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

3.1.1 垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響 通過對(duì)有無垃圾堆放的土壤細(xì)菌群落進(jìn)行Misep高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)無生活垃圾堆放的土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性均高于有生活垃圾堆放的。這與賀曉凌[12]研究垃圾填埋場(chǎng)近端的土壤微生物多樣性大于遠(yuǎn)端的結(jié)果不同;王曉琳[13]研究得出在不同填埋深度的土壤中，微生物多樣性隨深度增加而減少。這些相反的研究結(jié)果表明微生物的多樣性受多方面因素共同影響，如生活垃圾種類、堆放時(shí)間[14]、堆放地理位置[15]、土壤深度[5，13]等，與垃圾堆放的擾動(dòng)并不是線性相關(guān)。垃圾堆放過程中會(huì)產(chǎn)生含有有機(jī)化合物、病菌、寄生蟲以及有毒有害物質(zhì)和重金屬的高濃度有機(jī)廢水垃圾滲濾液，可通過地表徑流下滲至土壤中，本研究區(qū)域可能受垃圾污染嚴(yán)重，土壤微生物活性受到抑制，導(dǎo)致多樣性和豐富度下降。

3.1.2 垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌組成的影響 研究結(jié)果表明，2個(gè)處理土壤細(xì)菌種類在門水平上十分相似，但相對(duì)豐度有所不同。處理組中，優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria），這與吳雙等[16]、黃耀民等[17]研究結(jié)果一致。相較于對(duì)照組，厚壁菌門的增加幅度最大，綠彎菌門的減少幅度最大。厚壁菌門大都可以產(chǎn)芽孢，可以抵抗極端環(huán)境，因此能在被垃圾污染的環(huán)境中大量生存[18]。有報(bào)道稱，厚壁菌門（Firmicutes）的豐度與土壤中鉛、鋅、鎘和銅的含量呈顯著正相關(guān)[19]，而處理組厚壁菌門的相對(duì)豐度高于對(duì)照組43.68%，可以間接說明垃圾堆放導(dǎo)致土壤中重金屬含量增加，這與夏立江等[20]研究北京西郊垃圾堆放場(chǎng)中垃圾區(qū)的重金屬含量高于對(duì)照組的結(jié)果一致。綠彎菌門在旱地土壤中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而生活垃圾中廚余垃圾的含水率高，垃圾堆放會(huì)增加土壤的含水量，對(duì)綠彎菌門的豐度造成負(fù)面影響[21]。

土壤細(xì)菌類群比較復(fù)雜，在屬水平上，處理組有62%的未分類菌屬，對(duì)照組有78%的未分類菌屬，未知屬的價(jià)值有待于進(jìn)一步研究。相較于對(duì)照組，處理組中芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、膨脹芽孢桿菌屬（Tumebacillus）、未分類的動(dòng)球菌科的相對(duì)豐度增加;Rokubacteriales、厭氧繩菌科、虛構(gòu)芽孢桿菌屬（Fictibacillus）、MND1、Ramlibacter、溶桿菌屬（Lysobacter）的相對(duì)豐度減少。其中芽孢桿菌屬相較于對(duì)照組增加幅度最大，為26.56%。芽孢桿菌為環(huán)境樣品中的常見細(xì)菌，不僅具有較強(qiáng)的降解纖維素能力，而且還能降解芳香族化合物和重金屬絡(luò)合物，多生活在堿性、適鹽、高溫的環(huán)境下，通常為與垃圾填埋場(chǎng)環(huán)境較為相似的農(nóng)業(yè)廢棄物中的優(yōu)勢(shì)種群。垃圾覆蓋條件下土壤有益菌的相對(duì)豐度減少，其中溶桿菌屬對(duì)線蟲和植物病害具有生防作用[22];虛構(gòu)芽孢桿菌屬偏好堿性[23]，具有除磷[24]、抗蟲[25]、重金屬砷耐受性[25]等生物學(xué)活性，這些菌屬為土壤修復(fù)提供了寶貴的微生物資源。

3.1.3 垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌功能的影響 目前，針對(duì)垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌功能的研究開展較少，本研究將MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示，在level 1水平上不同處理均以代謝為主要功能，2組樣品預(yù)測(cè)功能基因多樣性保持一致，但相對(duì)豐度略有差別，其中處理組的代謝功能高于對(duì)照組。在level 2水平上代謝通路主要是碳水化合物代謝途徑，處理組高于對(duì)照組1.1%，可能是因?yàn)楹戏适欣闹饕煞譃橛袡C(jī)質(zhì)，所占比例達(dá)60%[26]，而有機(jī)質(zhì)含量高可以增強(qiáng)土壤微生物對(duì)各類碳源的代謝能力[27]。其中處理組中的優(yōu)勢(shì)菌門酸桿菌門作為嗜酸菌具有降解植物殘?bào)w多聚體、增強(qiáng)光合作用及參與單碳化合物代謝等功能[28]。在處理組的特有菌屬中，尿素芽孢桿菌屬可以利用各種有機(jī)物（單糖、雙糖、淀粉、有機(jī)酸等）作為碳源和能源[29]。在level 3水平上碳水化合物的代謝主要是通過丙酮酸代謝、糖酵解、氨基酸和核苷酸代謝、乙醛酸代謝、淀粉和蔗糖的代謝、檸檬酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等途徑。相較于對(duì)照組，處理組淀粉和蔗糖的代謝增加幅度最大。基于PICRUST只能對(duì)已知微生物的已知功能進(jìn)行功能預(yù)測(cè)的局限性，后期可以與宏基因組研究相結(jié)合，以更加深入地探討微生物的功能。

3.2 討論 生活垃圾堆放會(huì)顯著降低土壤細(xì)菌的多樣性，改變土壤細(xì)菌的群落組成，但不會(huì)改變土壤細(xì)菌群落的核心功能;不論是否堆放垃圾，土壤細(xì)菌的主要功能均為代謝，且都是碳水化合物代謝。由此可見，為降低垃圾堆放對(duì)土壤微生物及土壤質(zhì)量的影響，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)垃圾的分類收集及資源化利用。本研究取樣數(shù)量偏少，且缺少對(duì)土壤理化特性的分析，難以探究群落組成差異形成的機(jī)制，因此今后需增加該部分的研究，以全面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)生活垃圾堆放對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響。

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（責(zé)編：徐世紅）