周晨辰，查玉華，張硌

解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū)醫(yī)學(xué)工程科，北京 100071

核因子NF-κB是1986年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，因它與活化B細(xì)胞的免疫球蛋白κ輕鏈的增強子元件結(jié)合而得名[1]。NF-κB家族包含5個成員，即 NF-κB1（p105和 p50）、NF-κB2（p100和p52）、c-Rel、RelB和 RelA（p65）[2]。這些蛋白質(zhì)共享一個Rel同源域（RHD）[3]，該域介導(dǎo)DNA結(jié)合、二聚化，以及與特定抑制因子IκB的相互作用使其處于非激活狀態(tài)。上游信號如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等激活 NF-κB信號通路，進(jìn)而促使IκB降解，釋放的NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)的位點結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞因子、生長因子、促凋亡或抗凋亡蛋白等多種基因的轉(zhuǎn)錄[4-5]。

我們利用報告基因編碼易于檢測的酶或蛋白的性質(zhì)，通過對現(xiàn)有慢病毒載體的改造[6-7]，構(gòu)建了一種由上游激活序列UAS和NF-κB響應(yīng)元件作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控順式元件，以Pmin為啟動子，以GalVP64為放大調(diào)控因子，以mCherry為報告基因序列的表達(dá)載體，并進(jìn)一步構(gòu)建了受NF-κB調(diào)控表達(dá)mCherry熒光蛋白的細(xì)胞株。該細(xì)胞株可用于NF-κB活化狀態(tài)的檢測以及與NF-κB活化調(diào)控相關(guān)藥物的篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

293T、RAW264.7細(xì)胞，載體pCDH-GFP-PuronoCMV由本實驗室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA電泳凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，Q5高保真聚合酶，PCR試劑，DNA聚合酶，dNTPs購自NEB公司；DMEM購自Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清由Gibco公司生產(chǎn)；Lipo2000購自Invitrogen公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；UASSSCc-GV64mCherry表達(dá)調(diào)控序列由蘇州鴻訊科技合成。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ、BamHⅠ分別雙酶切pCDH-GFPPuro-noCMV載體與UAS-SSCc-GV64mCherry表達(dá)調(diào)控序列，酶切產(chǎn)物連接構(gòu)建為pCDH-UNPG-mCherry（圖1），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)并擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定。

1.3 慢病毒包裝

將293FT細(xì)胞接種于平皿中，細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時開始轉(zhuǎn)染?？傎|(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為9 μg，包括 PMD 1.5 μg、SPA 3 μg、pCDH-UNPG-mCherry 4.5 μg。轉(zhuǎn)染后8 h或過夜更換無抗生素培養(yǎng)基，36～48 h再補充5 mL無抗生素培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后72 h收上清，用0.22 μm濾器過濾。為提高病毒滴度，用10K離心過濾器4000 r/min離心20 min濃縮含病毒上清，-20℃保存或立刻使用。

1.4 RAW264.7細(xì)胞的感染及篩選

待感染的對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞接種至6孔板中，加入50 μL濃縮后的病毒，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，4～5 d可見部分細(xì)胞發(fā)綠色熒光。此時用5 μg/mL嘌呤霉素處理細(xì)胞24 h，然后換為新鮮的完全培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞生長，擴(kuò)大培養(yǎng)后于熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的有效性驗證

將上述獲得的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞計數(shù)，按1×105/孔加入24孔板，待細(xì)胞長至80%后加入10 ng/mL的NF-κB信號通路刺激物TNF-α，12 h后于熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒報告基因pCDH-UNPG-mCherry質(zhì)粒的鑒定

重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-UNPG-mCherry經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后得到約9000和1500 bp的2條帶，與pCDH-GFP-Puro-noCMV和UASSSCc-GV64mCherry的長度相符，并經(jīng)測序鑒定正確（圖2）。

2.2 pCDH-UNPG-mCherry RAW264.7細(xì)胞株的驗證

圖1 pCDH-UNPG-mCherry構(gòu)建示意圖

用包裝好的pCDH-UNPG-mCherry慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞，構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體包含mCherry基因片段，導(dǎo)入細(xì)胞后能夠表達(dá)具有綠色熒光蛋白特征的融合蛋白，在488 nm激發(fā)光照射下產(chǎn)生穩(wěn)定的綠色熒光。加入TNF-α刺激12 h后NF-κB信號通路激活，解離出的NF-κB與質(zhì)粒中的NF-κB響應(yīng)元件結(jié)合，啟動mCherry基因片段的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并在590 nm激發(fā)光照射下產(chǎn)生穩(wěn)定的紅色熒光。

如圖3所示，TNF-α誘導(dǎo)組的細(xì)胞有較強的mCherry表達(dá)，陽性率約為90%，而未加TNF-α組細(xì)胞mCherry陽性表達(dá)率約為10%。結(jié)果表明所構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒已在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受NF-κB調(diào)控表達(dá)mCherry熒光蛋白的pCDHUNPG-mCherryRAW264.7細(xì)胞株已成功建立，TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB慢病毒報告基因系統(tǒng)已構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pCDH-UNPG-mCherry的酶切電泳驗證

3 討論

NF-κB信號通路在多種生理和病理過程中起重要作用。激活的NF-κB通過介導(dǎo)靶基因來抑制正常細(xì)胞或癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活[8-9]。NF-κB還可以通過調(diào)控編碼抗氧化因子的基因來防止程序性壞死。鑒于其在癌癥發(fā)生和進(jìn)展中的作用，NF-κB信號通路是藥物干擾的一個強有力的靶點[10-13]。目前，對于NF-κB的鑒定主要是通過鑒定其信號通路特異性標(biāo)志物來實現(xiàn)的，由此衍生出許多方法，如Q-PCR、流式分選、Western印跡、免疫熒光，但這些方法大多步驟較為繁瑣，實驗周期較長。

本實驗通過將NF-κB的反應(yīng)元件與mCherry結(jié)合并構(gòu)建在慢病毒表達(dá)載體中，將載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，通過熒光的有無來鑒別目的細(xì)胞對NF-κB活性的響應(yīng)，從而起到分選鑒別NF-κB激活的作用。利用這種“開關(guān)”效應(yīng)可極大地提高實驗效率，并可直接用于以TNF-α或其受體家族為靶點的藥物篩選及活性檢測。由于NF-κB是細(xì)胞內(nèi)多個信號通路的交匯點，因此該細(xì)胞系具備通用性，具有研究及應(yīng)用價值

圖3 pCDH-UNPG-mCherry RAW264.7細(xì)胞株的鑒定