周晨辰，陸琤，何園，查玉華，張硌

解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心南院區(qū)醫(yī)學(xué)工程科，北京 100071

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）屬于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）家族，是一個重要的細(xì)胞內(nèi)多功能泛素連接酶[1-4]。TRAF6蛋白結(jié)構(gòu)主要分為C端和N端。N端含有1個保守的RING環(huán)指結(jié)構(gòu)域和5個鋅指結(jié)構(gòu)域，其中RING環(huán)指結(jié)構(gòu)域及第1個鋅指結(jié)構(gòu)域是TRAF6蛋白的主要功能區(qū)域，行使其作為E3泛素連接酶的主要功能。TRAF6的C端結(jié)構(gòu)域呈三聚蘑菇頭狀結(jié)構(gòu)，含有卷曲螺管樣結(jié)構(gòu)域（莖）和TRAF-C（頭）兩部分[5-6]。

作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)多功能信號分子，TRAF6交織于一系列信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，從而影響細(xì)胞的生存、增殖、分化和死亡[7-10]。為進一步探討TRAF6在細(xì)胞功能調(diào)控中發(fā)揮的作用，我們利用反向PCR技術(shù)[11]構(gòu)建了TRAF6截短體TRAF6 N和TRAF6 C的表達(dá)質(zhì)粒，為TRAF6分子的后續(xù)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

293FT細(xì)胞、真核質(zhì)粒pCMV-Myc-TRAF6和pCMV-Myc-X為本實驗室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA電泳凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；KODPlus-Mutagenesis試劑盒購自TOYOBO公司；脂質(zhì)體LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；Myc抗體購自MBL公司；抗鼠IgG-HRP購自Jackson公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、蛋白marker及ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；Glutathione Sepharose4B購自GE Healthcare公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 PCR引物的設(shè)計與合成

采用反向PCR法構(gòu)建TRAF6截短體質(zhì)粒。目標(biāo)截短體為TRAF6 N和TRAF6 C。根據(jù)Gen-Bank公布的人源TRAF6 cDNA編碼區(qū)序列和對應(yīng)的氨基酸序列，TRAF6 N為TRAF6氨基酸序列的前288位殘基，TRAF6 C為后234位殘基（圖1）。PCR引物由北京生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

反向PCR法是以環(huán)狀DNA為模板，以反方向設(shè)計的2條引物對質(zhì)粒進行完整的PCR。因此，反向PCR引物應(yīng)在缺失序列的外側(cè)開始設(shè)計，并考慮載體序列和相應(yīng)的內(nèi)切酶識別序列[11]。真核質(zhì)粒pCMV-Myc-TRAF6序列內(nèi)TRAF6兩端內(nèi)切酶位點分別為EcoRⅠ和XhoⅠ。用于TRAF6 N截短體的正向引物為5′TCTCGAGGTACCGCGGC CGCGGGGATC3′，反向引物 為 5′ATACCCAGAGT CGGGTATAACGCTCAA3′；用于 TRAF6 C 截短體的正向引物為5′ATCTCAGAGGTCCGGAATTTCC AGGAA3′，反向引 物為 5′CCGAATTCGGGCCTCC ATGGCCATAAG3′。

圖1 TRAF6蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 截短體質(zhì)粒的構(gòu)建

反向PCR法整個過程不需要瓊脂糖凝膠電泳的參與，僅包括“反向PCR→消化模板→PCR產(chǎn)物自身環(huán)化”[11]三步。

50 μL反向PCR反應(yīng)體系包括蒸餾水35 μL，10×緩沖液 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，10 μmol/L 正向引物 1.5 μL，10 μmol/L 反向引物1.5 μL，50 ng/μL 模板 DNA Myc-TRAF6 1 μL，KOD-Plus酶 1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃ 2 min，98℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃退火 6 min，10 個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在50 μL PCR反應(yīng)液中加入2 μLDpnⅠ，37℃反應(yīng)1 h，消化模板。PCR產(chǎn)物自身環(huán)化體系：DpnⅠ處理后PCR產(chǎn)物2 μL，蒸餾水 7 μL，Ligation high 5 μL，T4DNA聚合酶 1 μL，16℃反應(yīng)1 h。

1.4 轉(zhuǎn)化及提取

取感受態(tài)大腸桿菌DH5α 100 μL，將上述自身環(huán)化后的產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至其中，涂布在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜，次日觀察平板，挑取5個陽性菌落移至5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩過夜。擴增培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。

1.5 病毒包裝和轉(zhuǎn)染

293FT細(xì)胞按1×106/孔接種于12孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，次日將目的質(zhì)粒用脂質(zhì)體LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，8 h后換液。

1.6 免疫印跡法檢測目的基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，用RIPA裂解液［50 mmol/L Tris（pH7.4），150 mmol/L NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑］裂解細(xì)胞，SDS-PAGE分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至NC膜，脫脂牛奶封閉液封閉1 h；加入一抗，室溫溫育2 h或4℃溫育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入相應(yīng)的二抗，室溫溫育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；將ECL顯色液加到膜上，用保鮮膜把膜包起來，放入Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)中曝光、顯影，保存數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 TRAF6截短體基因克隆的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化過夜后，觀察LB瓊脂平板上菌落生長情況。由圖2可見，轉(zhuǎn)化對照組pCMV-Myc-TRAF6質(zhì)粒后菌落密集，說明轉(zhuǎn)化體系無異常情況；反向PCR法獲得的pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMVMyc-TRAF6 C質(zhì)粒均有少量菌落產(chǎn)生，可進一步對其進行鑒定。

2.2 pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C質(zhì)粒的鑒定

pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別得到約900和750 bp的條帶，與TRAF6 N和TRAF6 C的長度相符，說明目的質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)染后TRAF6 N和TRAF6 C蛋白的表達(dá)

以轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-TRAF6為對照組，pCMVMyc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C為實驗組，并以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果見圖4，轉(zhuǎn)染后TRAF6 N和TRAF6 C蛋白能在293FT細(xì)胞中正常表達(dá)，與TRAF6蛋白的表達(dá)無明顯差異。說明pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C構(gòu)建成功。

圖2 轉(zhuǎn)化后TRAF6截短體基因克隆菌落生長情況

圖3 pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜

圖4 Western印跡檢測TRAF6 N和TRAF6 C蛋白在293FT細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

蛋白質(zhì)截短體和點突變體在研究蛋白質(zhì)本身結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用，如借助蛋白質(zhì)截短體和點突變體研究蛋白質(zhì)磷酸化、泛素化、甲基化，蛋白與蛋白之間的相互作用等，有助于對蛋白分子所發(fā)揮的生物學(xué)功能進行排除和確認(rèn)。為快速推進實驗進程，本研究采用反向PCR技術(shù)構(gòu)建了TRAF6蛋白截短體質(zhì)粒pCMV-Myc-TRAF6 N和pCMV-Myc-TRAF6 C，并經(jīng)酶切、轉(zhuǎn)染和Western印跡證實其融合蛋白的正確性，為深入探討TRAF6生物功能特性提供了便利。