楊娜，李彬，李素芬，王唯斯，自加吉，熊偉，2

1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 a.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；b.病理學(xué)教研室；云南 大理 671000；

2.云南省高校臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000

惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是一種來源于胸膜間皮細(xì)胞的原發(fā)腫瘤，占胸膜腫瘤的5%，臨床少見[1]。胸膜間皮瘤可發(fā)生于臟層胸膜和壁層胸膜的任何部分，80%發(fā)生于臟層胸膜，20%發(fā)生于壁層胸膜；可發(fā)生于任何年齡，常見于40～60歲[1]。胸膜間皮瘤是由環(huán)境、生物和遺傳因素引起的腫瘤。石棉已被國際癌癥研究中心（IARC）確定為致癌物[2]，在美國和西方國家石棉被認(rèn)為是導(dǎo)致惡性間皮瘤的主要原因。在不同國家，MPM的發(fā)病率差異較大，國外以澳大利亞最高，發(fā)病率約為3.54/10萬，國內(nèi)每年發(fā)病率為0.3/10萬～0.5/10萬，以云南省最高，約為8.5/10萬～17.75/10萬[3-4]。目前對(duì)該病的診斷及治療較棘手，早期診斷可以提高M(jìn)PM患者的生存率，一些用于早期診斷的分子標(biāo)志物如間皮素（mesothelin），癌胚抗原（CEA），糖類抗原CA125、CA153、CA199和細(xì)胞表明標(biāo)志物CD90等的敏感性和特異性均有限[5]。目前，MPM的診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍為胸腔鏡活檢，缺乏較為便捷有效且低痛苦的診斷方法，發(fā)掘新的MPM診斷方法能夠?yàn)榛颊叩脑缙谠\斷和治療提供依據(jù)。

人表皮生長(zhǎng)因子含纖蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1（epidermal growth factor containing fibulin like extracellular matrix protein 1，EFEMP1）基因定位于染色體2p16.1，含有12個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)物為纖蛋白3（fibulin 3）[6]。纖蛋白家族共7個(gè)成員，纖蛋白3含有493個(gè)氨基酸殘基，在不同物種中高度保守，在人類、大鼠和小鼠中92%～94%的氨基酸序列同源。纖蛋白3是一種細(xì)胞外糖蛋白，廣泛分布于發(fā)育中的組織與成熟組織中，在生理?xiàng)l件下通常以單體形式存在。研究發(fā)現(xiàn)，纖蛋白3在MPM患者的血漿和胸水中水平顯著升高，且敏感性和特異性較高[7-8]。目前，EFEMP1基因表達(dá)與MPM發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。因此，本研究旨在闡明EFEMP1基因mRNA在MPM組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其與臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析EFEMP1基因mRNA在MPM組織與非腫瘤組織中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前最大的腫瘤基因芯片整合平臺(tái)和分析平臺(tái)，可用于對(duì)目標(biāo)基因的篩選及該基因在不同組織中的表達(dá)分析。本研究在Oncomine數(shù)據(jù)庫中設(shè)置條件為：①“Gene：EFEMP1”；②“Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”；③“Cancer Type：Other Cancer-Mesothelioma-Pleural Malignant Mesothelioma”；④“Simple Type：Clinical Specimen”。對(duì)纖蛋白3在MPM組織與非腫瘤組織中的表達(dá)差異進(jìn)行分析。

1.2 下載TCGA數(shù)據(jù)庫中MPM數(shù)據(jù)集的病理資料與患者預(yù)后資料

使用R3.6.3軟件，利用Epicalc函數(shù)包，從美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http://tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）中 下載并預(yù)處理MPM數(shù)據(jù)集中EFEMP1基因mRNA表達(dá)量的數(shù)據(jù)集，同時(shí)下載MPM患者的臨床病理參數(shù)和預(yù)后資料，將2個(gè)數(shù)據(jù)集根據(jù)對(duì)應(yīng)的TCGA病例編號(hào)進(jìn)行合并。

1.3 對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中MPM數(shù)據(jù)集進(jìn)行篩選及病理相關(guān)性分析

通過R3.6.3下載合并得到的數(shù)據(jù)集meso_tcga中包含87例MPM病例樣本。通過對(duì)臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選比對(duì)，刪除缺失數(shù)據(jù)及無效數(shù)據(jù)，僅保留完整有效的數(shù)據(jù)82例。根據(jù)RNA測(cè)序結(jié)果分析，MPM樣本中EFEMP1基因表達(dá)量為1646.753～115 390.589，中位表達(dá)量為28 250.071。以中位表達(dá)量為截?cái)嘀担瑯颖局蠩FEMP1表達(dá)量高于中位數(shù)的定義為高表達(dá)（high），反之為低表達(dá)（low），2組均為41例。

1.4 MPM組織的病理學(xué)分型

TCGA數(shù)據(jù)庫中MPM數(shù)據(jù)集將MPM組織的病理學(xué)分型分為3種，即肉瘤樣型（Sarcomatoid Type）、上皮樣型（Epithelioid Type）和雙向混合型（Biphasic Type），依次分別包括2例、57例、23例。

1.5 EFEMP1基因mRNA表達(dá)水平對(duì)MPM患者預(yù)后的影響

采用基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn）數(shù)據(jù)庫對(duì)數(shù)據(jù)構(gòu)建Kaplan-Meier模型，探究EFEMP1基因mRNA表達(dá)水平與MPM患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1.6 EFEMP1基因mRNA表達(dá)水平與其他基因表達(dá)的相關(guān)性分析

cBioportal（http://www.cbioportal.org/）是基于公共數(shù)據(jù)庫研究分析癌癥基因數(shù)據(jù)的可視化工具，通過自定義數(shù)據(jù)探求基因改變和臨床之間的聯(lián)系，并使其可視化。選擇MPM組織和EFEMP1基因，可得出MPM中EFEMP1基因與其他基因表達(dá)的相關(guān)性可視化分析圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

建立MPM患者的臨床病理數(shù)據(jù)集，將患者年齡、性別、AJCC病理分期、T分期、M分期、N分期、病理類型、組織學(xué)診斷和EFEMP1基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行量化賦值。采用R3.6.3和Graphpad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖，使用Shapiro-Wilk方法檢測(cè)MPM組織中EFEMP1基因mRNA表達(dá)量的正態(tài)分布情況，結(jié)果顯示EFEMP1基因mRNA表達(dá)量不符合正態(tài)分布（P＜0.05）。因此，MPM組織的EFEMP1基因mRNA表達(dá)量比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)。組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法進(jìn)行臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析?；颊哳A(yù)后分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進(jìn)行Logrank檢驗(yàn)。采用Pearson或Spearman法進(jìn)行基因表達(dá)的相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 EFEMP1基因mRNA在MPM組織中的表達(dá)量顯著高于正常組織

對(duì)Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)篩選分析，所得結(jié)果顯示在正常組織以及有關(guān)MPM的共54個(gè)樣本中，與正常肺組織和正常胸膜組織相比，EFEMP1基因在MPM組織中的表達(dá)量顯著升高，且組間差異極顯著（P＜0.01），結(jié)果如圖1。

2.2 MPM組織中EFEMP1基因mRNA表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

圖1 正常組織與MPM組織中EFEMP1基因mRNA表達(dá)量差異

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理得到臨床病理參數(shù)完整的82例MPM病例資料，其中女性16例、男性66例，年齡28.0～81.0歲，中位年齡64.0歲。對(duì)該數(shù)據(jù)集中MPM患者預(yù)后的各影響因素進(jìn)行賦值，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得知MPM組織中EFEMP1基因mRNA低表達(dá)41例、高表達(dá)41例。結(jié)果表明，EFEMP1基因mRNA表達(dá)量與MPM患者的T分期（P=0.046）、病理類型（P=0.031）及組織學(xué)診斷類型（P=0.031）存在顯著相關(guān)性，而與患者的年齡、性別、N分期、M分期、AJCC病理分期均無顯著相關(guān)性（均P＞0.05）。結(jié)果見表1。

2.3 EFEMP1基因mRNA表達(dá)量與MPM患者的預(yù)后無顯著相關(guān)性

用GEPIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建Kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行Logrank法檢驗(yàn)，結(jié)果表明EFEMP1基因的表達(dá)對(duì)MPM患者的總生存率（overall survive，OS）及無疾病進(jìn)展生存率（disease free survive，DFS）均無顯著影響（LogrankP＞0.05）。結(jié)果如圖2。

2.4 MPM組織中EFEMP1基因與其他基因mRNA表達(dá)量的相關(guān)性

通過cBioportal工具對(duì)MPM組織中EFEMP1基因表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行可視化分析。選取在MPM組織中EFEMP1基因表達(dá)相關(guān)性最高的9個(gè)基因，分別為UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2（UDP-glucosepyrophosphorylase2，UGP2）、轉(zhuǎn) 錄 因 子 4（transcription factor 4，TCF4）、活化的T細(xì)胞核因子 4（nuclear factor of activated T cells 4，NFATC4）、RAS 相 關(guān) 基 因 2（rasrelated 2，RRAS2）、膜聯(lián)蛋白 A3（annexin A3，ANXA3）、柔滑素（smoothelin，SMTN）、尿蛋白 1B（uroplakin 1B，UPK1B）、醇脫氫酶 6（alcohol dehydrogenase 6，ADH6）和DNA損傷識(shí)別和修復(fù)因子XPC復(fù)合體（XPC complex subunit，XPC）基因。其中，UGP2、RRAS2、ANXA3、UPK1B、ADH6、XPC與EFEMP1基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），TCF4、NFATC4、SMTN與EFEMP1基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

3 討論

表1 EFEMP1基因mRNA表達(dá)量與MPM患者臨床病理特征的相關(guān)性

圖2 EFEMP1基因mRNA表達(dá)量與總生存率的關(guān)系

MPM是一種罕見的胸腔惡性腫瘤，起源于胸膜腔的間皮細(xì)胞[9]。MPM總體預(yù)后較差，上皮型MPM預(yù)后相對(duì)較好，肉瘤型預(yù)后最差，未經(jīng)治療的MPM中位生存期為12個(gè)月，6個(gè)月、1年和5年的生存率分別為55%、33%和5%[10]。MPM是一種致死性極強(qiáng)的腫瘤，其惡性程度高，潛伏期長(zhǎng)，早期臨床表現(xiàn)無特異性，多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期[11]。MPM在早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療等環(huán)節(jié)的檢查技術(shù)薄弱，缺乏特異性診斷和預(yù)后的腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物。纖蛋白3可以單獨(dú)表現(xiàn)出與組織特異性表達(dá)有關(guān)的抑癌或致癌行為[12-13]。研究顯示，纖蛋白3在MPM患者中的表達(dá)水平普遍升高，且纖蛋白3不僅在腫瘤組織中過表達(dá)，在胸腔積液和血漿中也有較高水平的表達(dá)[14]。由此提出，纖蛋白3可能在MPM中起致癌作用。對(duì)MPM細(xì)胞系的體外研究及體內(nèi)移植瘤研究進(jìn)一步表明MPM細(xì)胞表達(dá)和分泌纖蛋白3，并且是患者血漿樣本中纖蛋白3的來源。在生理情況下，纖蛋白3以單體形式存在，在正常組織中低表達(dá)，而在內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的基膜中高表達(dá)，可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與間質(zhì)之間的信號(hào)傳導(dǎo)[15]。近年來許多實(shí)驗(yàn)也證明，纖蛋白3可正向調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化增殖，并參與腫瘤細(xì)胞抗凋亡作用[16-18]。關(guān)于纖蛋白3在各種類型腫瘤中的研究，特別是在MPM中的表達(dá)及意義也越來越受到人們的關(guān)注。

圖3 MPM組織中EFEMP1基因與其他基因mRNA表達(dá)量的相關(guān)性

在本研究中，我們首先通過數(shù)據(jù)挖掘分析了EFEMP1基因mRNA的表達(dá)與MPM發(fā)生之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EFEMP1基因在正常肺組織或正常胸膜組織中均低表達(dá)，在MPM組織中顯著高表達(dá)，并且EFEMP1基因mRNA的表達(dá)量與腫瘤的T分期、病理類型及組織學(xué)診斷類型有顯著相關(guān)性。莫世賢采用隨機(jī)效應(yīng)模型，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組（MPM組）患者血液及胸腔積液的纖蛋白3水平高于對(duì)照組（非MPM組）[19]。因此，纖蛋白3對(duì)于診斷MPM具有較高程度的敏感性和特異性，可作為MPM臨床早期診斷的輔助方法。為了比較纖蛋白3與間皮素作為MPM相關(guān)生物標(biāo)志物的價(jià)值，Creaney等采用ELISA測(cè)定了153例胸腔積液患者血漿和胸水中的纖蛋白3及間皮素水平，發(fā)現(xiàn)間皮素在診斷MPM方面優(yōu)于纖蛋白3，而在判斷患者預(yù)后方面則是纖蛋白3更優(yōu)[20]。然而，本研究的預(yù)后生存分析結(jié)果顯示，EFEMP1基因mRNA表達(dá)量與MPM患者的總體生存率和無疾病進(jìn)展生存率之間并無顯著關(guān)聯(lián)?；虮磉_(dá)相關(guān)性分析表明，UGP2、RRAS2、ANXA3、UPK1B、ADH6、XPC與EFEMP1基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，TCF4、NFATC4、SMTN與EFEMP1基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，提示EFEMP1基因在MPM發(fā)生過程中可能需要與其他基因相互協(xié)同才能發(fā)揮作用。

MPM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床病例較為少見。本研究使用TCGA中MPM數(shù)據(jù)集的病例數(shù)據(jù)及預(yù)后資料，臨床數(shù)據(jù)樣本量更大，所得結(jié)果的可信度較高。綜上研究表明，EFEMP1基因mRNA在MPM組織中過表達(dá)，它可以作為該疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物，這可為MPM的臨床診療提供一定的參考。