王金西，郭曉娟，程錦紅，張紹東，焦保庭，檀曉東

1.邯鄲市第一醫(yī)院 普外四科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市中心醫(yī)院 病理科，河北 邯鄲 056001

慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率較高，其目的基因可與宿主細(xì)胞基因組整合，且能夠長(zhǎng)期表達(dá)。倘若某些腫瘤細(xì)胞的表型基因完全被敲除，最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤死亡，必然影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行?？烧T導(dǎo)shRNA是建立在四環(huán)素操縱子系統(tǒng)基礎(chǔ)上的shRNA可誘導(dǎo)系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，四環(huán)素操縱子（TetO）序列能夠與四環(huán)素阻遏蛋白（TetR）結(jié)合，并能取代polⅢ啟動(dòng)子中的非必需序列。四環(huán)素阻遏蛋白可以使含有四環(huán)素操縱子的啟動(dòng)子阻止 siRNA 的轉(zhuǎn)錄。四環(huán)素（tetracycline，Tet）或多西環(huán)素（doxycycline，DOX）與四環(huán)素阻遏蛋白結(jié)合，可以改變四環(huán)素阻遏蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致四環(huán)素操縱子序列上的四環(huán)素阻遏蛋白脫落，從而使shRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)[8]。本研究通過(guò)構(gòu)建針對(duì)c-Met基因的shRNA慢病毒載體，擬建立可調(diào)控表達(dá)shRNA的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)于上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代；大腸桿菌HB101、Top10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；TA載體、pSD400質(zhì)粒、pMDL質(zhì)粒、pRSV質(zhì)粒、pMDG質(zhì)粒由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院饋贈(zèng)；Megatran1.0購(gòu)于ORIGEN公司；DNA提取試劑盒購(gòu)于Axygen公司；BamHⅠ FastDigest酶、EcoRⅠ FastDigest酶購(gòu)于Fermentas公司；胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、0.25%胰酶（Trypsin-EDTA）、嘌呤霉素購(gòu)于邁晨科技有限公司；鼠抗人c-Met單抗購(gòu)于CalBiochem公司；兔抗人GAPDH單抗購(gòu)于Cell Signaling公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于Santa Cruz公司。

1.2 shRNA序列的設(shè)計(jì)

登入GenBank尋找c-Met mRNA序列，在Ambion公司網(wǎng)址（https://www.Genscript.Com/ss-lbin/app/rnai）尋找人c-Met的RNA干擾靶點(diǎn)序列并設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的單鏈核苷酸序列。根據(jù)靶點(diǎn)序列及shRNA設(shè)計(jì)策略（BamHⅠ酶切位點(diǎn)+正義鏈+Loop+反義鏈+終止信號(hào)+HindⅢ酶切位點(diǎn)），設(shè)計(jì)4對(duì)shRNA序列（3對(duì)干擾序列及1對(duì)隨機(jī)對(duì)照序列）。引物 1，c-Met-Up-primer：5'-TGGATCCAA GGTCGGGCAGGAAGAG-3'；c-Met-Down-primer 1：5'-AGGATCCAAAAAAGAATGTCATTCTACATG AGCCTCTTGAGCTCATGTAGAATGGACATTCTGGT GTTTCGTCCTTTCCAC-3'。引物2，c-Met-Up-primer：5'-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3'，c-Met-Down-primer 2：5'-AGGATCCAAAAAATCAGAACCA GAGGCTTGGTCCTCTTGAGACCAAGCCTCTGGTTCTG ATGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3'。引物3，c-Met Upprimer：5'-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3'，c-Met Down-primer 3：5'-AGGATCCAAAAACATGG CTCTAGTTGTCGACGAGTACTGGTCGACAACTAGAGC CATGGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3'。 引 物 4，Scramble Up-primer：5'-TGGATCCAAGGTCGGGCAG GAAGAG-3'，Scramble Down-primer：5'-AGGATCCA AAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTG GTGCTCTTCATCTTGTTGGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3'。經(jīng)Blast基因同源性分析，此序列不與人類任何基因序列同源。

1.3 TA-c-Met-shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將合成的成對(duì)寡核苷酸引物用滅菌去離子水溶解并稀釋，建立PCR體系（反應(yīng)條件：94℃2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min）。PCR結(jié)束后將反應(yīng)體系進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲取目標(biāo)c-Met-shRNA雙鏈寡核苷酸。用TA-DNA連接酶將雙鏈寡核苷酸與TA載體定向連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10細(xì)胞，在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上培養(yǎng)，挑選抗氨芐青霉素的菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)，裂解菌落并提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ酶切，瓊脂糖電泳鑒定目的片段與載體質(zhì)粒。連接成功的質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序。

1.4 TA-c-Met-shRNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后檢測(cè)c-Met表達(dá)變化

采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體（Megatran1.0）轉(zhuǎn)染法。轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于六孔板中，設(shè)置3個(gè)接種復(fù)孔。細(xì)胞濃度為4×105/mL，每孔2 mL新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞增至約80%時(shí)，將構(gòu)建的4個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，37℃、5% CO2孵箱中孵育8～10 h，更換新鮮的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。72 h后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品30 μg進(jìn)行Western印跡，檢測(cè)c-Met蛋白的表達(dá)。經(jīng)9% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液常溫封閉1 h，洗膜后分別加入兔抗人c-Met多克隆抗體1∶500、GAPDH抗體1∶3000，再分別用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG堿性磷酸酶抗體（1∶3000）進(jìn)行二抗雜交，最后加入化學(xué)發(fā)光試劑放射自顯影，成像儀拍照記錄。用ANOVNHolm-Sidak軟件分析各蛋白條帶的吸光度值。

1.5 pSD400-c-Met-shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將TA-c-Met-shRNA1用BamHⅠ酶切，得到含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)的shRNA1線性片段。pSD400質(zhì)粒亦經(jīng)BamHⅠ酶切，得到含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)的線性片段，使其去磷酸化。將去磷酸化的線性pSD400質(zhì)粒和從TA質(zhì)粒中提取的c-Met-shRNA1 DNA片段用連接酶連接起來(lái)，形成pSD400-c-met-shRNA重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌HB101，用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選（pSD400質(zhì)粒中含有抗氨芐青霉素的基因）。將篩選出的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。將PCR驗(yàn)證成功的菌落培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。由于pSD400質(zhì)粒中含有4個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，環(huán)狀質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切后會(huì)出現(xiàn)4條大小不同的條帶。質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切驗(yàn)證后送基因公司測(cè)序。

1.6 shRNA慢病毒包裝

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞用胰酶消化，用A液（不含丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，加入非必需氨基酸，不含雙抗）培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞接種于六孔板，4×105/孔，于 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。用Megatran1.0將pSD400-c-Met-shRNA/pSD400-scramble-shRNA、pRSV、pMDL、VSVG等4種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6 h后培養(yǎng)基更換為B液（含丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基，3%胎牛血清，加入非必需氨基酸，不含雙抗）。分別收取48和72 h的病毒液。

1.7 顯微鏡下觀察確定嘌呤霉素篩選藥物濃度

經(jīng)不同濃度嘌呤霉素篩選7 d后，藥物濃度為0.8 μg/mL時(shí)即可殺死全部細(xì)胞，故最終確定嘌呤霉素篩選濃度為0.8 μg/mL。

1.8 慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞

將病毒液加入提前鋪有MDA-MB-231細(xì)胞的六孔板里，3×105/孔（去掉原有的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基），孵育24 h后加入終濃度為0.8 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選。

自動(dòng)尋路的關(guān)鍵是路徑規(guī)劃，分為全局路徑規(guī)劃和局部路徑規(guī)劃。本系統(tǒng)為了呈現(xiàn)整體樣板房的效果，故而采用全局路徑規(guī)劃。即根據(jù)設(shè)定的路徑信息，借助路徑搜索算法，利用不同目標(biāo)結(jié)點(diǎn)提供給客戶不一樣的選擇，從而產(chǎn)生不盡相同的漫游路線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這個(gè)系統(tǒng)的漫游。在Unity3D 中由NavMesh 組件完成尋路開(kāi)發(fā)，其核心算法是用三角形代替?zhèn)鹘y(tǒng)網(wǎng)格，計(jì)算拐點(diǎn)優(yōu)化尋路路徑，算法實(shí)現(xiàn)過(guò)程如圖1 所示。

1.9 穩(wěn)定細(xì)胞系的驗(yàn)證

用嘌呤霉素篩選7～10 d后，空白組MDAMB-231細(xì)胞全部死亡，而pSD400-c-Met-shRNAMDA-MB-231組和pSD400-scramble-MDA-MB-231組有多個(gè)單克隆細(xì)胞出現(xiàn)。單克隆細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)達(dá)到一定數(shù)量后，提取細(xì)胞DNA基因組，用設(shè)計(jì)好的pSD400質(zhì)粒的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)pSD400片段。

1.10 篩選出最適多西環(huán)素誘導(dǎo)濃度

選擇對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的pSD400-c-Met1-shRNAMDA-MB-231 細(xì)胞接種于六孔板，4×105/孔,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL的多西環(huán)素進(jìn)行誘導(dǎo)，72 h后提蛋白，Western印跡篩選最適多西環(huán)素濃度。

1.11 MTT法檢測(cè)適當(dāng)敲除c-Met基因后對(duì)細(xì)胞增殖的影響

把pSD400-c-Met1-shRNA-MDA-MB-231、pSD400-scramble-MDA-MB-231、MDA-MB-231等3種細(xì)胞接種于六孔板，4×105/孔，加入 0.4 μg/mL多西環(huán)素進(jìn)行誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)3 d的細(xì)胞用0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為 1.5×104/mL，將細(xì)胞接種于 96孔板，1500/孔，每板設(shè)6組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。為防止邊緣效應(yīng)，周邊各孔加入200 μL PBS。細(xì)胞于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。設(shè)置6個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，分別是12、24、48、72、96、120 h。 加 入 MTT（5 mg/mL）20 μL，避光孵育4 h后去除96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，搖勻10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的D490nm值。

2 結(jié)果

2.1 TA-c-Met-shRNA載體的鑒定

將提取的4組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ酶切，電泳（圖1）得到2 kb左右和370 bp左右的2條帶，說(shuō)明目的片段與TA載體質(zhì)粒連接成功，命名為T(mén)A-c-Met-shRNA。測(cè)序證實(shí)連接的干擾序列與設(shè)計(jì)序列完全正確（序列略）。

2.2 TA-c-Met-shRNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后c-Met蛋白表達(dá)的變化

轉(zhuǎn)染72 h后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western印跡，重復(fù)3次，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染組，3個(gè)TA-c-MetshRNA組的c-Met蛋白表達(dá)均有所下降，TA-c-Met-shRNA1下降最顯著（P＜0.05），對(duì)照組則無(wú)明顯下降（圖2）。

2.3 pSD400-c-Met-shRNA質(zhì)粒鑒定

提取的2組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證后行凝膠電泳（圖3），BamHⅠ酶切后370 bp位置均出現(xiàn)了目的條帶，說(shuō)明目的片段與pSD400載體質(zhì)粒連接成功。EcoRⅠ酶切后出現(xiàn)4條大小不等的條帶，說(shuō)明EcoRⅠ酶切成功，將質(zhì)粒命名為pSD400-c-Met-shRNA/pSD400-scramble-shRNA。測(cè)序證實(shí)插入的干擾序列與設(shè)計(jì)序列完全正確。

圖1 TA-c-Met-shRNA載體BamHⅠ酶切電泳圖

圖2 Western印跡檢測(cè)shRNA沉默c-Met后的蛋白表達(dá)效率（*P＜0.05）

2.4 慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞

慢病毒包裝成功后感染MDA-MB-231細(xì)胞，24 h后加入終濃度為0.8 μg/mL的嘌呤霉素篩選7 d，由于pSD400質(zhì)粒中含有抗嘌呤霉素基因序列，當(dāng)pSD400質(zhì)粒被慢病毒整合到MDA-MB-231細(xì)胞基因組后，MDA-MB-231細(xì)胞就具有了耐嘌呤霉素的特性，pSD400-c-Met-shRNA細(xì)胞組有數(shù)個(gè)細(xì)胞單克隆形成（pSD400-c-Met-shRNAMDA-MB-231），pSD400-scramble組有細(xì)胞單克隆形成（pSD400-scramble-MDA-MB-231）；空白組MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)無(wú)抗嘌呤霉素基因表達(dá)，在嘌呤霉素存在的條件下細(xì)胞全部死亡（圖4）。

2.5 穩(wěn)定細(xì)胞系的驗(yàn)證

圖 3 pSD400-c-Met、pSD400-scramble-shRNA 載體BamHⅠ、EcoRⅠ酶切電泳圖

圖4 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞系

圖5 PCR驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞系內(nèi)含有pSD400載體

圖6 Western印跡檢測(cè)不同濃度多西環(huán)素誘導(dǎo)pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞后的蛋白表達(dá)

分別以pSD400-c-Met1-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞 DNA、pSD400-scramble-shRNA-MDAMB-231細(xì)胞DNA、pSD400質(zhì)粒、MDA-MB-231細(xì)胞DNA為模板，用pSD400質(zhì)粒引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pSD400質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，MDA-MB-231細(xì)胞為陰性對(duì)照，結(jié)果以穩(wěn)定細(xì)胞株DNA、pSD400質(zhì)粒為模板的PCR反應(yīng)后同時(shí)擴(kuò)增出了約500 bp的條帶，而MDA-MB-231細(xì)胞為模板的PCR反應(yīng)中無(wú)條帶出現(xiàn)。說(shuō)明穩(wěn)定細(xì)胞株DNA中含有pSD400質(zhì)粒，MDA-MB-231細(xì)胞中本身不含有pSD400質(zhì)粒（圖5）。

分別選擇 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL的多西環(huán)素誘導(dǎo)pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細(xì)胞株；用0.5 μg/mL多西環(huán)素誘導(dǎo)pSD400-c-Met-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞株，Western印跡檢測(cè)c-Met蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示pSD400-c-MetshRNA-MDA-MB-231細(xì)胞株在不同濃度多西環(huán)素誘導(dǎo)下c-Met蛋白表達(dá)量呈逐漸遞減趨勢(shì)，且在0.5 μg/mL濃度下c-Met蛋白表達(dá)量接近于0；pSD400-scramble-MDA-MB-231細(xì)胞株無(wú)論有、無(wú)多西環(huán)素誘導(dǎo)，c-Met表達(dá)量無(wú)明顯變化（圖6）。

2.6 適當(dāng)敲除c-Met基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

將3種細(xì)胞株（pSD400-c-Met-shRNA-MDAMB-231、pSD400-scramble-MDA-MB-231、MDAMB-231）接種于 96孔板，加入 0.4 μg/mL 多西環(huán)素分別誘導(dǎo)12、24、48、72、96、120 h，在各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)MTT法讀取D490nm值。pSD400-c-Met-shRNAMDA-MB-231細(xì)胞株加入多西環(huán)素誘導(dǎo)后，由于c-Met基因被適當(dāng)敲除，在第3 d出現(xiàn)了細(xì)胞增殖的抑制，與不加多西環(huán)素組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而 pSD400-scramble-MDA-MB-231、MDA-MB-231無(wú)論加或不加多西環(huán)素誘導(dǎo)，細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖7）。

3 討論

原癌基因c-Met位于人染色體7q21-31，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為190 000的跨膜糖蛋白。c-Met蛋白在多種上皮細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，但不存在于間質(zhì)細(xì)胞中[9]，其屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族，是HGF的上皮特異性受體。HGF或SF由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生并作為c-Met受體的配體，形成HGF/SF-c-Met內(nèi)分泌信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。配體的結(jié)合可使c-Met受體的酪氨酸激酶磷酸化，促使細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞動(dòng)力和向腺上皮的形態(tài)分化[10]。Jin等[11]研究顯示，乳腺癌c-Met蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率約為70%，與乳腺癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞增殖、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中，c-Met蛋白的異常表達(dá)扮演了重要角色。因此，c-Met可能作為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。近年來(lái)，人工設(shè)計(jì)的c-Met受體拮抗劑在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)能有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[12-13]。馮煒紅等[14]研究顯示，c-Met抑制劑可抑制c-Met及AKT磷酸化，抑制腫瘤細(xì)胞增生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖7 適當(dāng)敲除c-Met對(duì)細(xì)胞增殖的影響

siRNA是21～23 bp的雙鏈RNA分子，可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因特異性沉默，這種RNA干擾可以通過(guò)體外合成的siRNA反式感染細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)或者通過(guò)表達(dá)載體在體內(nèi)表達(dá)siRNA，后者是一種可用于在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)siRNA的方法。目前，大多數(shù)siRNA表達(dá)載體都是通過(guò)聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子U6和H1來(lái)驅(qū)動(dòng)siRNA轉(zhuǎn)錄的。這些啟動(dòng)子特別適合于shRNA的表達(dá)。然而，使用穩(wěn)定整合的siRNA特異性抑制基因表達(dá)不適合沉默與細(xì)胞生長(zhǎng)或存活有關(guān)的基因。在這種情況下，調(diào)節(jié)siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)就至關(guān)重要。有能力控制一個(gè)特定siRNA的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量，使得研究其對(duì)宿主的時(shí)間和濃度依賴性效應(yīng)成為可能，并使細(xì)胞在siRNA啟動(dòng)前和正常細(xì)胞一樣生長(zhǎng)。此方法可用于研究宿主細(xì)胞對(duì)siRNA的存在和缺失的反應(yīng)，往往有助于進(jìn)一步了解靶基因的功能[16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)合成單鏈RNA，經(jīng)過(guò)提純、雜交成雙鏈RNA，再根據(jù)RNA干擾原理構(gòu)建了shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，酶切電泳分析證實(shí)目的基因準(zhǔn)確插入TA載體質(zhì)粒，基因測(cè)序證實(shí)基因序列正確。將TA載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，72 h提取蛋白，Western印跡檢測(cè)的c-Met蛋白表達(dá)下降是一致的，而TA-c-Met-shRAN2、TA-c-MetshRAN3組下降不明顯，證實(shí)RNA干擾具有序列特異性。隨機(jī)對(duì)照序列組（TA-scramble-shRNA）及空白對(duì)照（MDA-MB-231細(xì)胞）未出現(xiàn)這種作用，說(shuō)明TA載體及轉(zhuǎn)染試劑本身無(wú)RNA干擾效應(yīng)。用BamHⅠ將攜帶目的基因的shRNA片段自TA載體切除、提純，并將該片段插入pSD400載體進(jìn)行慢病毒包裝，感染MDA-MB-231細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，檢測(cè)證實(shí)穩(wěn)定細(xì)胞系內(nèi)含有針對(duì)c-Met的shRNA片段。經(jīng)梯度濃度的多西環(huán)素誘導(dǎo)后，穩(wěn)定細(xì)胞系的c-Met表達(dá)量亦呈梯度變化。多西環(huán)素濃度為0.4 mg/mL時(shí)c-Met沉默率可達(dá)80%左右，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)中等量細(xì)胞死亡。以上結(jié)果為下一步探討適當(dāng)敲除c-Met基因后乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療、放療敏感性檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。