湯 雄，黃 潔，柯云霞

(江西省九江市第三人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

目前，乙型肝炎病毒在中國一直呈現(xiàn)高感染率狀態(tài)，HBV的攜帶者約有1.3億，占全球患病人數(shù)的十分之一，感染現(xiàn)象較為嚴重[1]。核苷酸類似物是目前乙型肝炎病毒治療的主力軍，但近年來發(fā)現(xiàn)由于核苷酸類似物的廣泛、長期不規(guī)范的使用，我國各地乙型肝炎患者體內(nèi)均出現(xiàn)不同程度對核苷酸類似物的耐藥突變[1-2]。一旦發(fā)生耐藥情況，會大大降低抗病毒藥物對乙型肝炎病毒復制能力的抑制作用。從而因為錯誤用藥，延誤患者的病情錯過最佳治療時機[3]。因此，檢測乙型肝炎病毒的基因型和耐藥基因位點分析有助于HBV患者選擇更合理的治療方案，對患者病情的改善及預后都有非常重要的臨床意義[4-5]。

在對乙型肝炎患者在核苷類似物治療過程中DNA病毒載量下降并持續(xù)免疫應答，但治療一段時間出現(xiàn)病毒學復發(fā)，本研究對患者此時的基因型及幾種核苷酸類似物耐藥情況進行分析，以探討和改善當?shù)氐囊倚透窝谆蜃儺惡湍退幍那闆r，降低耐藥發(fā)生率，提高療效實現(xiàn)個體化治療，對治療乙肝炎有著重要意義。

1 材料與方法

1.1一般資料：選取2017年9月～2019年2月我院傳染門診及住院的慢性乙型肝炎感染患者152例，納入標準HBV-DNA陽性(拷貝數(shù)>1.0×103)，其中男92例，女60例，平均年齡為(42.16±13.33)歲，患者均來自于九江地區(qū)市、縣，均符合2015年中華醫(yī)學會全國CHB診斷標準。所有病例的其他肝炎病毒(甲、丙、丁、戊)均為陰性，同時排除其他疾病感染。152例患者中，單獨拉米夫定用藥占30.9%(47例)，單獨恩替卡韋用藥占13.8%(21例)，單獨阿德福韋酯用藥占21.7%(33例)、拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯用藥占33.6%(51 例)。

1.2主要試劑與儀器:主要試劑：QIAampMinElute Virus Spin Kit，(德國Qiagen公司，貨號57704)；2×Phanta?Max Master Mix，(南京諾唯贊生物，貨號：P515-02)；HBV核酸熒光檢測試劑盒(中山大學達安基因試劑公司，批號：2018007)。主要儀器：BioRad S1000 PCR儀；Biorad PAC300電泳儀；BioRad GEL DOC XR+凝膠成像系統(tǒng)；ABI3730XL測序儀。

1.3檢測方法

1.3.1HBV-DNA定量檢測所有患者標本留取清晨空腹靜脈血3 ml，2 h內(nèi)分離血漿。采用美國ABI7300 熒光定量PCR擴增儀進行擴增、定量分析，使用HBV核酸熒光檢測試劑盒，并嚴格按照說明書操作。

1.3.2HBV耐藥基因突變檢測及基因分型：從血清或血漿樣本提取HBV DNA，通過PCR擴增HBV P區(qū)RT段序列，共檢測21個耐藥位點：rt80、rt84、rt85、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt207、rt213、rt214、rt215、rt229、rt233、rt236、rt237、rt238、rt250，耐藥位點覆蓋HBV對拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋等抗病毒藥物發(fā)生耐藥的主要位點，其次進行擴增電泳產(chǎn)物分析，觀察瓊脂糖凝膠中對照品是否符合(HBV DNA陰性對照無條帶，HBV-DNA陽性對照有清晰條帶，且條帶大小為871 bp)及患者HBV-DNA是否有條帶及條帶大小(見圖1)。然后使用ABI3730xl測序儀對擴增的PCR產(chǎn)物進行測序。突變分析：使用生物分析軟件Sequencher5.4.6將測序序列與NCBI發(fā)布的參考序列進行比對，進而分析耐藥位點氨基酸是否發(fā)生突變。型別分析：將序列提交NCBI Genotyping tool，進行在線分型；或者使用Sequencher 5.4.6結合NCBI Blast功能進行批量序列分析；對于少數(shù)重組型樣本，使用SimPlot 3.5進行重組分析。

1.4統(tǒng)計學處理：采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1152例乙型肝炎耐藥患者的基因位點突變分布情況：本地區(qū)的152例乙型肝炎耐藥檢測中，97例檢測出變異株，總耐藥率為63.8%，其中單獨拉米夫定用藥的變異株29例，以rt204I/V、rt180M為主要的耐藥突變位點，突變率占單獨拉米夫定用藥全部突變位點的39.7%和29.7%，單獨恩替卡韋用藥的變異株14例，以rt204I/V、rt180M、rt202G/I為主要的耐藥突變位點，突變率分別是27.1%、44.1%和12.3%。單獨阿德福韋酯用藥的變異株18例，rt204I/V、rt180M、rt236T位點突變率分別是35.9%、23.4%和23.4%，拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯用藥的變異株36例， rt204I/V、rt180M、rt181T/V、rt236T位點突變率分別為38.2%、33.1%、13.9 %和4.4%。

注：M為marker，P561-P581為患者血清擴增結果，POS為陽性對照，N1和N2為陰性對照圖1 乙型肝炎患者HBV-DNA血清PCR分析電泳結果

2.2不同基因型的乙型肝炎DNA在某個位點突變率比較：HBV-DNA的B基因型rt204、rt180位點突變率與C基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C基因型的rt181V位點突變率高于B基因型，B基因型的rt236T位點突變率高于C基因型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他基因型各位點突變率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 97例不同基因型在不同位點突變率情況分析[例(%)]

2.3HBV的B、C基因型與幾種核苷酸類似物突變位點rt204V+rt180M的關系:在97例耐藥患者中，耐藥見于B、C型基因型，以B基因型為主，B+C混合型未見耐藥基因突變型耐藥，突變位點rt204V+rt180M的突變率在拉米夫定和恩替卡韋中最高，分別為57.4%、40.4%，其次是替比夫定和恩曲他濱34.0%。見表2。

表2 97例不同基因型與幾種核苷酸類似物突變位點rt204V+rt180M的關系[例(%)]

3 討論

DNA的閉合環(huán)狀結構容易導致其發(fā)生不同程度的突變，HBV在復制過程中由于RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校準功能，HBV基因組的突變率較其他DNA病毒高出10倍。隨著核苷酸類似物抗病毒藥物在HBV治療的廣泛應用，耐藥率逐漸增高，耐藥不僅導致病情的發(fā)展惡化，加大醫(yī)治難度，增加醫(yī)療成本[6]。近幾年，通過對核苷類藥物發(fā)生 HBV 耐藥突變機制的逐步了解和HBV基因分型對HBV抗病毒的臨床指導作用的認識，為臨床醫(yī)生及時調(diào)整治療策略，降低乙型肝炎病毒耐藥突變帶來的危害，實現(xiàn)對慢性乙型肝炎患者個體化治療具有重要的指導意義[7]。

本研究利用巣式PCR和Sanger測序法對九江地區(qū)152例慢性乙型肝炎患者進行HBV核苷類似物耐藥突變及基因型檢測。結果顯示，九江地區(qū)的慢性乙型肝炎HBV基因型以B型、C型為主，B型占明顯優(yōu)勢(70.8%)，C型感染者病情發(fā)展比較重，一般在重癥肝炎、原發(fā)性肝癌病例中 C基因型較為多見，與很多南方地區(qū)報道[7-8]一致。在152例樣本中檢測到97例發(fā)生耐藥變異，突變率為63.8%，其中以rt204V、rt180M的單點突變?yōu)橹?，兩個位點突變率分別高達37.2%和37.9%。97例樣本中單獨拉米夫定用藥和拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯用藥的變異株最多，拉米夫定、阿德福韋酯和恩替卡韋是目前臨床上應用較廣泛、安全有效的三種核苷類抗HBV病毒藥物，前期臨床試驗表明，拉米夫定和阿德福韋酯可以快速有效地抑制HBV-DNA的復制合成及抑制病毒活性，但不足以清除HBV，所以慢性乙型肝炎患者的抗病毒治療是一個漫長的過程，在長期的抗病毒治療中容易產(chǎn)生病毒變異[9-10]。本研究中，拉米夫定耐藥相關位點除了rt204V、rt180M外，還檢測有rt217R、rt80I、rt207L等位點，恩替卡韋耐藥相關突變還有rt202G/I、rt184G 及 rt173L等位點。由于九江地區(qū)醫(yī)藥匱乏，很多患者只能使用第一代核苷類似物進行抗病毒治療，從而出現(xiàn)大量拉米夫定和阿德福韋酯變異株，因此產(chǎn)生多重耐藥的患者應該謹慎合理用藥，及時檢測耐藥突變位點，合理優(yōu)化治療方案，避免病情進一步加重。

綜上所述，九江地區(qū)乙型肝炎HBV以B基因型為主，B+C混合型型未見耐藥基因突變型，B基因型的rt204V、rt180M突變率最高，并以單獨拉米夫定用藥和拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯用藥這兩種抗HBV方案產(chǎn)生耐藥株為主，所以慢性乙型肝炎患者在進行藥物治療前必須選擇好無耐藥性的藥物，在治療過程中及時了解耐藥突變體的流行情況，加強對乙型肝炎治療效果評估，為制訂本地的預防耐藥提供理論參考。