邵婧

（信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗科,河南 信陽 464000）

慢性乙型肝炎主要是由于乙肝病毒感染引起的肝臟炎性疾病,感染發(fā)生后,通過一系列途徑對免疫系統(tǒng)進行激活,從而引起肝臟炎癥,因此臨床針對慢性乙型肝炎的研究多集中于免疫學(xué)機制方面,但對于該癥患者固有免疫系統(tǒng)的特征及作用研究尚不充分［1-2］。機體對乙肝病毒抗原的細胞免疫應(yīng)答是肝細胞損傷、病毒清除的重要原因,包括自然殺傷（NK）細胞、細胞因子等,機體免疫狀態(tài)、病毒復(fù)制能力對乙肝病毒感染的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸具有重要影響［3-4］。因此,了解機體免疫功能與病毒復(fù)制的關(guān)系對臨床進行個體化治療意義重大?；诖?本研究以84 例慢性乙型肝炎患者為研究對象,旨在進一步探討其外周血NK 細胞含量與病毒載量的相關(guān)性,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018 年2 月至2019 年6 月期間于信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院接受治療的84 例慢性乙型肝炎患者的臨床資料,視其乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）載量的不同,將入選者分為對照組（HBV-DNA 低載量,HBV-DNA 載量103～106cps/mL）與觀察組（HBV-DNA 高載量,HBVDNA 載量≥106cps/mL）各42 例。對照組男31 例,女11 例；年齡29～63 歲,平均（48.64±4.72）歲；疾病分度：輕度21 例,中度13 例,重度8 例；體重指數(shù)（BMI） 19～29 kg/m2,平均（23.51±1.25）kg/m2；受教育年限5～19 年,平均（12.59±3.41）年。觀察組男30 例,女12 例；年齡28～64歲,平均（49.13±4.86）歲；疾病分度：輕度19例,中度16 例,重度7 例；BMI 19～28 kg/m2,平均（23.36±1.31）kg/m2；受教育年限5～18 年,平均（12.38±3.52）年。兩組性別、年齡、BMI、受教育年限比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）,具有可比性。

1.2 入選標準

納入標準：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015 年版）》［5］中慢性乙型肝炎診斷標準者；②臨床資料完整者；③近期未接受免疫調(diào)節(jié)劑、核苷（酸）類似物或干擾素抗病毒治療者；④年齡不超過65 歲。排除標準：①自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、酒精性肝炎等其他肝炎病毒重疊感染者；②合并惡性腫瘤或嚴重心臟病、高血壓、糖尿病等其他重癥疾病者；③合并自身免疫系統(tǒng)疾病者；④嚴重心、腎等器官功能衰竭者；⑤表達障礙或精神疾病者；⑥合并人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者；⑦甲型、丙型、戊型肝炎病毒感染者。

1.3 方法

①外周血單個核細胞分離：采集兩組入選者抗凝血5 mL,加入生理鹽水（5 mL）混勻,緩慢加至淋巴細胞分離液（5 mL）上層,溫室、800 r離心20 min,吸出中間霧狀層,加磷酸緩沖鹽溶液（PBS）混勻,溫室、800 r 離心10 min,將上層清液棄去,沉淀使用PBS 洗滌2 次,得到外周血單個核細胞。②流式細胞術(shù)檢測外周血單個核細胞中NK 細胞比例：儀器選擇BD 公司生產(chǎn)的型號為LSRFortessa X-20 的流式細胞儀,使用25 ng/mL丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）、10μg/mL 布雷菲德菌素A（BFA）、1 μg/mL 離子霉素,37℃、5% CO2孵箱中刺激細胞4 h,對細胞表面抗原進行染色,而后進行細胞固定、破膜,再分別使用TNF-α-APC、IFN-γ-PE-Cy7 對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）進行標記,PBS 清洗后,加入400μL PBS 重懸細胞,流式細胞儀上機檢測,所得圖像及數(shù)據(jù)采用FACSDiva（BD）軟件處理。

1.4 評價指標

分析比較兩組患者外周血NK 細胞含量。外周血NK 細胞含量正常值參考范圍：8.1%～25.6%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示,用t檢驗；外周血NK 細胞含量與HBV-DNA 載量相關(guān)性采用Pearson分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者外周血NK 細胞含量比較

觀察組外周血NK 細胞含量高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者外周血NK 細胞含量比較（n=42,,%）

表1 兩組患者外周血NK 細胞含量比較（n=42,,%）

2.2 外周血NK 細胞含量與HBV-DNA 載量相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),外周血NK 細胞含量與HBV-DNA 載量呈負相關(guān)（r=-0.409,P=0.000）。

3 討論

慢性乙型肝炎主要指乙肝病毒檢測為陽性,存在慢性肝炎癥狀但發(fā)病日期不明確或病程超過半年者,以乏力、惡心、畏食、腹脹、肝區(qū)疼痛為主要臨床表現(xiàn),若不能及時給予有效的治療,則可能導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭、原發(fā)性肝細胞癌等,嚴重威脅患者生命安全［6-7］。HBV-DNA 高載量可增加慢性乙型肝炎患者發(fā)生肝硬化、肝癌的風(fēng)險,但乙肝病毒并不直接造成肝細胞損傷,機體免疫狀態(tài)、病毒復(fù)制與慢性乙型肝炎活動存在密切關(guān)系,感染發(fā)生后,免疫反應(yīng)發(fā)生異?；罨?在慢性乙型肝炎的發(fā)生與發(fā)展中起到重要作用［8］。因此對慢性乙型肝炎發(fā)病過程中免疫學(xué)機制進行深入探討,對其病理機制闡明甚至新免疫學(xué)療法的研發(fā)意義重大。

免疫應(yīng)答可分為特異性免疫及固有免疫,已有研究證實乙肝病毒特異性免疫應(yīng)答在其中起到重要作用。但在慢性乙型肝炎中,乙肝病毒特異性CD8+T 細胞數(shù)量減少,且對活化信號反應(yīng)性降低,即使在有效抗旨病毒復(fù)制之后,其功能及數(shù)量仍難以恢復(fù)［9］。因此,對固有免疫與HBV-DNA載量的相關(guān)性進行研究,可能是一個新的突破點。NK 細胞是固有免疫的重要組成部分,可以顆粒酶、穿孔素形式介導(dǎo)細胞間信號傳導(dǎo)、細胞因子分泌、細胞毒作用,通過表達受體或配體傳遞細胞間信號、介導(dǎo)細胞凋亡,分泌TNF-α、IFN-γ 等細胞因子對免疫反應(yīng)進行調(diào)節(jié)等［10］。NK 細胞是一類不受主要組織相容性復(fù)合體（MHC）類分子限制、不需要特異性抗原激活的淋巴細胞,可直接殺傷靶抗原。NK 細胞根據(jù)不同功能可分為抑制性受體或活化受體兩類,其功能也主要通過以上兩類受體分別傳遞抑制、活化性信號的平衡來調(diào)節(jié)。慢性乙型肝炎患者機體固有免疫功能相對低下,NK 細胞功能呈下降趨勢。本研究結(jié)果顯示,觀察組外周血NK 細胞含量高于對照組,外周血NK 細胞含量與HBV-DNA 載量呈負相關(guān)。肝臟發(fā)生炎癥時,肝臟中淋巴細胞富集浸潤,趨化性細胞因子水平上升,這可能是外周血NK 細胞減少的機制之一。經(jīng)抗病毒治療,慢性乙型肝炎患者炎癥緩解、病毒載量下降,NK 細胞比例上升,慢性乙型肝炎患者非活動期NK 細胞比例甚至高于健康人群。此外,NK 細胞在慢性乙型肝炎患者中的表型和功能也發(fā)生改變,NK 細胞的抗病毒功能出現(xiàn)缺陷,其抑制性受體NKG2A 水平上升,分泌IFN-γ 功能下降,不利于快速清除機體病毒［11］。導(dǎo)致NK 細胞功能紊亂的上游機制尚不能十分明確,一方面可能與慢性乙型肝炎中部分抑制性細胞因子水平升高,致使其功能下降有關(guān),另一方面可能與血液循環(huán)中樹突狀細胞、庫普弗細胞等通過細胞因子旁分泌途徑和細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進而對NK 細胞產(chǎn)生影響有關(guān)［12］。

綜上所述,慢性乙型肝炎HBV-DNA 高載量患者外周血NK 細胞含量顯著低于HBV-DNA 低載量患者,外周血NK 細胞含量與HBV-DNA 載量呈負相關(guān),固有免疫在抗乙肝病毒感染中起到重要作用,對開發(fā)基于調(diào)控固有免疫的慢性乙型肝炎患者新療法存在一定參考意義。