原昕，趙夢佳，張欣，袁良杰

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 泰安271000］

帕金森病是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性缺失為特征的一種神經(jīng)退行性疾?。?］。胰島素樣生長因子-1（insulin like growth factor-1,IGF-1）是一種分子量為70 個氨基酸的神經(jīng)營養(yǎng)因子,在外周主要來源于肝臟［2］；在中樞神經(jīng)系統(tǒng),IGF-1在中腦黑質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)均有表達［3］。在帕金森病的發(fā)病過程中,血清中IGF-1 水平發(fā)生改變。臨床研究發(fā)現(xiàn),帕金森病患者在發(fā)病早期血清中的IGF-1 水平升高［4］,隨著疾病的進展血清中含量降低［5］。表明IGF-1 的濃度變化參與了帕金森病的發(fā)生、發(fā)展。IGF-1 具有神經(jīng)保護作用,離體細胞實驗研究證明,IGF-1 能夠?qū)笰β25-35 誘導(dǎo)的SH-SY-5Y 細胞的凋亡［6］。AYADI 等［7］研究表明,IGF-1 能夠?qū)?-OHDA 誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。不同濃度的IGF-1 是否能夠發(fā)揮保護多巴胺能神經(jīng)元的作用,以及下游的信號分子機制是什么而有待進一步深入研究。本實驗采用多巴胺能細胞系SH-SY5Y 細胞作為研究對象,利用神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methy-4-phenylpyridinium,MPP+）損傷SH-SY5Y 細胞,制備帕金森病離體細胞模型,研究不同濃度的IGF-1對SH-SY5Y 細胞的保護作用,以及胰島素樣生長因子-1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R）阻斷劑JB-1 和PI3K 阻斷劑LY294002 對IGF-1 神經(jīng)保護作用的阻斷效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人源胰島素樣生長因子-1（human insulin like growth factor-1,hIGF-1） 購自美國Biovision （93-4119-1000）公司,溶于0.9%Nacl、MPP+（D-048）購自美國Sigma 公司,溶于0.01M PBS、JB-1 購自美國Sigma 公司,LY294002 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗均購自美國GIBCO 公司,胎牛血清購自北京Cell Max公司,抗Bax 和Bcl-2 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司,抗β-actin 抗體購自美國博士德生物工程有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

SH-SY5Y 細胞常規(guī)培養(yǎng),隨機分為對照組、MPP+組、IGF-1 （25 ng/mL） +MPP+組、IGF-1（50 ng/mL）+MPP+組及IGF-1（100 ng/mL）+MPP+組。將SH-SY5Y 細胞接種于6 孔板中,待細胞融合度達到80%～90%,分別加入不同濃度的IGF-1（25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL）預(yù)保護24 h；然后加入MPP+（1 mM）共同處理24 h。根據(jù)實驗結(jié)果選出最佳保護濃度將細胞種于6 孔板內(nèi),分為對照組、MPP+組、IGF-1+MPP+組、IGF-1+JB-1組及IGF-1+LY294002+MPP+組進行機制研究。

1.3 免疫印跡法檢測Bax 和Bcl-2 的蛋白表達

細胞處理48 h 后,將6 孔板中的培養(yǎng)基棄掉,用預(yù)冷的0.01 M PBS 小心洗3 遍,加入RIPA 裂解液,冰上裂解40 min,用細胞刮將細胞輕輕刮下,收集裂解液到離心管中。在4℃以12 000 r/min 離心20 min,吸取上清液。采用BCA 法檢測蛋白濃度后,加入5x loading buffer 充分混勻,95℃孵育5 min；然后將蛋白保存于-80℃冰箱,用于Western blotting 檢測。將保存好的蛋白,按照每孔15 μg 的蛋白質(zhì)量進行電泳；電泳結(jié)束后,300 mA恒壓轉(zhuǎn)膜90 min,將帶有蛋白條帶的PVDF 膜封閉于5%的脫脂牛奶1 h,然后一抗孵育,4℃搖床24 h；然后TBST 洗膜3 遍,二抗孵育,室溫1 h；然后加入發(fā)光液進行蛋白檢測。采用Image J 軟件讀取蛋白灰度值,進行蛋白含量的分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示,比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較用Tukey法,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的IGF-1 對MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞Bax 和Bcl-2 蛋白表達的影響

MPP+處理細胞24 h,與對照組比較,Bax 蛋白表達上調(diào),Bcl-2 蛋白下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度的IGF-1（25、50 及100 ng/mL）與MPP+共同孵育細胞,能夠抑制Bax 蛋白表達的上調(diào),以及Bcl-2 蛋白表達的下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。25 ng/mL IGF-1 不能抑制Bcl-2 蛋白表達的下調(diào),后續(xù)實驗選用50 ng/mL IGF-1 作為機制研究。見表1。

2.2 JB-1 或LY294002 阻斷IGF-1 對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞Bcl-2 和Bax 蛋白的表達作用

JB-1 或LY294002 提前預(yù)處理細胞1 h,IGF-1（50 ng/mL）預(yù)保護細胞24 h,然后與MPP+共處理細胞24 h。采用Western blotting 檢測凋亡因子Bax和Bcl-2 蛋白表達的影響。結(jié)果顯示,MPP+組與對照組比較,Bax 上調(diào),而Bcl-2 降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與IGF-1+MPP+組比較,Bax 表達水平降低,而Bcl-2 表達水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LY294002 能夠阻斷IGF-1 的該作用（P＜0.05）,JB-1 和LY294002 能夠阻斷IGF-1抑制MPP+誘導(dǎo)的Bax/Bcl-2 比值升高（P＜0.05）。見表2。

表1 不同濃度的IGF-1 對抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞Bcl-2 和Bax 蛋白的表達 （）

表1 不同濃度的IGF-1 對抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞Bcl-2 和Bax 蛋白的表達 （）

注：1）與對照組比較,P＜0.05；2）與MPP+組比較,P＜0.05。

表2 JB-1 或LY294002 阻斷IGF-1 對Bcl-2 和Bax 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用 （）

表2 JB-1 或LY294002 阻斷IGF-1 對Bcl-2 和Bax 蛋白表達的調(diào)節(jié)作用 （）

注：1）與對照組比較,P＜0.05；2）與MPP+組比較,P＜0.05；3）與IGF-1+MPP+組比較,P＜0.05。

3 討論

MPP+是由MPTP 在星形膠質(zhì)細胞的單胺氧化酶B 的作用下轉(zhuǎn)化成的代謝產(chǎn)物。MPP+被多巴胺轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元,發(fā)揮神經(jīng)毒性作用,成為目前帕金森病研究常用的神經(jīng)毒素［8-9］。因此在本實驗研究中采用MPP+制備帕金森病離體細胞模型。越來越多的數(shù)據(jù)證實,IGF-1 參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病［10-12］,IGF-1 能夠?qū)谷毖跞毖T導(dǎo)的神經(jīng)元損傷［13］、興奮性毒性損傷［14］及小腦共濟失調(diào)［15］。本實驗結(jié)果表明,IGF-1 能夠?qū)筂PP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞的凋亡,該作用可被JB-1 和PI-3K 特異性阻斷劑LY294002 所阻斷。Bcl-2 家族,如Bcl-2 和Bax 在細胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵作用［16］。Bax/Bcl-2 的比值是評價細胞凋亡的一項有價值指標(biāo)［17］。本實驗結(jié)果證實,與MPP+組相比,IGF-1 能夠上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達,而下調(diào)Bax 蛋白的表達。IGF-1 能夠拮抗MPP+誘導(dǎo)的Bax/Bcl-2 比值增加,說明IGF-1 能夠通過抑制凋亡提高細胞的存活,發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）信號通路在神經(jīng)元存活中發(fā)揮重要作用,PI3K 信號通路通過抑制Forkhead、Bad 和糖原激酶3-β 的活性,以及增加IAP 和Bcl-2 水平抑制細胞凋亡［18］。XU 等［19］報道,TN-2 通過PI3K 通路保護PC12 細胞對抗6-OHDA 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。本實驗中提前加入PI3K 的特異性阻斷劑LY294002能夠阻斷IGF-1 的抗凋亡作用,說明IGF-1 的神經(jīng)保護作用與PI3K 信號通路有關(guān)。

綜上所述,不同濃度的IGF-1 能夠?qū)筂PP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細胞的凋亡,該作用可能與IGF-1R/PI3K 信號通路有關(guān)。