張華，楊黎明，袁路，劉敏，張富青

（鄭州市婦幼保健院 生殖遺傳科,河南 鄭州 450012）

孕早期自然流產(chǎn)在所有臨床妊娠中的發(fā)生率約為15%～20%［1］,大多數(shù)流產(chǎn)發(fā)生于妊娠前10周。引起自然流產(chǎn)的原因眾多,常見的包括內(nèi)分泌因素,解剖因素,免疫因素,微生物感染,遺傳因素,男性因素。其中,遺傳因素尤其是胚胎染色體異常被認(rèn)為占所有自然流產(chǎn)的50%～65%［2-4］。因此,流產(chǎn)絨毛染色體檢測(cè)對(duì)于明確流產(chǎn)原因是至關(guān)重要的。

高通量測(cè)序技術(shù)（high throughput sequencing）也稱為二代測(cè)序（next generation sequencing,NGS）技術(shù),它是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)革命性的改變。可一次進(jìn)行全基因組水平DNA 序列測(cè)定,具有檢測(cè)周期短,高通量,高分辨率,高敏感性和高準(zhǔn)確性等優(yōu)勢(shì),不僅能檢出染色體非整倍體,還可檢出＞100 kb 的染色體基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations,CNVs）。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018 年1 月至2019 年9 月在鄭州市婦幼保健院生殖遺傳科就診并成功進(jìn)行流產(chǎn)絨毛染色體分析的自然流產(chǎn)患者520 例?；颊呔鶎?duì)本研究知情同意,孕周小于12 周,既往月經(jīng)規(guī)律,無孕期感染史。

1.2 研究方法

凱杰試劑盒提取絨毛組織DNA 后進(jìn)行文庫構(gòu)建,用NextSeq CN500 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。數(shù)據(jù)分析參照DGV :http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home,OMIM：http://omim.org/,DECIPHER:http://decipher.sanger.ac.uk/,PubMed:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed。變異分析參照HGMD ClinVar 和ACMG。

2 結(jié)果

520 例流產(chǎn)絨毛中,201 例染色體結(jié)果正常,319 例異常,異常率為61.3%。染色體非整倍體295 例（56.7%）,致病性染色體拷貝數(shù)變異24 例（4.6%）。異常核型中,出現(xiàn)頻率從高到低依次為：常染色體三體（包括嵌合型）（64.6%）,三倍體（10.7%）,X 單體（8.8%）,致病性CNVs（7.5%）。見圖1。

圖1 異常絨毛染色體核型分布頻率

2.1 常染色體三體

共檢出206 例常染色體三體,包括189 例純合三體和17 例常染色嵌合三體。除1 號(hào)染色體三體未檢出外,其余常染色體三體均檢出,但它們分布頻率差異較大。最常見的三種常染色體三體是16 三體（28.8%）,22 三體（10.5%）和15 三體（8.4%）,見圖2。在17 例嵌合型三體中,16 三體嵌合比例最高。

圖2 常染色體三體核型分布

2.2 三倍體和四倍體

三倍體占所有異常核型的10.7%（34/319）。四倍體占所有異常核型的1.6%（5/319）,其中一例是嵌合型：92,XNNN/46,XN。

2.3 單體型

主要為X 單體,占所有異常核型的8.8%（28/319）,未發(fā)現(xiàn)純合常染色單體型,發(fā)現(xiàn)一例嵌合型,即45,XN,-22/46,XN。

2.4 復(fù)合三體型

共發(fā)現(xiàn)14 例復(fù)合三體型,占所有異常核型的4.4%,見表1。

表1 14 例復(fù)合三體型

2.5 染色體拷貝數(shù)變異

共檢出24 例致病性染色體拷貝數(shù)變異（CNVs）,占所有異常核型的7.5%（24/319）。主要涉及的染色體為1 號(hào),4 號(hào),8 號(hào)和10 號(hào)。其中1 例證實(shí)來源于其平衡易位的父親。

3 討論

自然流產(chǎn)的病因是極其復(fù)雜的,包括內(nèi)分泌因素,生殖道畸形,感染因素,免疫因素,遺傳因素及一些還未闡明的其他因素。盡管醫(yī)學(xué)在不斷進(jìn)步,但孕早期自然流產(chǎn)依然是一個(gè)重要的健康問題。尤其是隨著國(guó)家二胎政策的放開,許多年紀(jì)較大的夫婦選擇再次生育。他們面臨的問題不僅是能否順利懷孕,更多的可能還面臨著早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。這給很多家庭帶來了沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對(duì)流產(chǎn)絨毛進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)不僅可以明確流產(chǎn)原因,還可為遺傳咨詢和再次妊娠提供有用信息：如果絨毛染色體結(jié)果正常,則可從其他方面查因；如果絨毛染色體結(jié)果異常,則可避免不必要的檢測(cè)和錯(cuò)誤的治療方案,科學(xué)指導(dǎo)下次妊娠；如果意義未明,建議追查父母染色體,一般認(rèn)為,來源于父母的變異不是導(dǎo)致流產(chǎn)的原因。

檢測(cè)流產(chǎn)絨毛染色體的方法主要有三種：染色體核型分析,染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis,CMA）和高通量測(cè)序法。染色體核型分析是目前公認(rèn)的檢測(cè)染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn),能檢測(cè)46 條染色體的數(shù)目異常和大的結(jié)構(gòu)異常（包括平衡性結(jié)構(gòu)異常）,但其在應(yīng)用中存在諸多缺點(diǎn)。首先,核型分析需要進(jìn)行絨毛細(xì)胞培養(yǎng),檢測(cè)周期長(zhǎng),對(duì)標(biāo)本質(zhì)量要求較高,如污染可導(dǎo)致培養(yǎng)失敗而得不到檢測(cè)結(jié)果。其次,由于整個(gè)流程都是人工操作,對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高,而穩(wěn)定性較差。此外,核型分析分辨率有限,不能檢出染色體拷貝數(shù)變異,對(duì)＜5%低比例嵌合的檢出率也較低。CMA 是一種快速有效的染色體分析技術(shù),通過一次實(shí)驗(yàn)就能檢出全基因組內(nèi)的非平衡性染色體異常,但其缺陷是通量低,檢測(cè)成本高。另外,由于其依賴探針雜交,對(duì)于探針未覆蓋區(qū)域的異常無法檢出。高通量測(cè)序?qū)?biāo)本質(zhì)量要求低,用量小,周期短,通量高,可通過對(duì)測(cè)序深度的調(diào)整檢測(cè)＞100 kb 以上的染色體拷貝數(shù)變異,逐漸應(yīng)用于流產(chǎn)絨毛染色體的檢測(cè)。

本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)520 例流產(chǎn)絨毛進(jìn)行檢測(cè),共檢出異常核型319 例,異常率為61.3%。據(jù)報(bào)道,傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)方法對(duì)異常核型的檢出率為50% 左右,如李春艷（51.72%）［5］,朱蕊（47.3%）［6］,沈素巖（51.2%）［7］,李金鴿（51.92%）［8］。筆者的研究結(jié)果表明,高通量測(cè)序的異常檢出率明顯高于細(xì)胞學(xué)方法,提高約10%。即便如此,流產(chǎn)絨毛的染色體異常率仍可能被低估,因?yàn)樽匀涣鳟a(chǎn)發(fā)生的孕周較早,有一些甚至在臨床上還未發(fā)現(xiàn)妊娠時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了自然流產(chǎn)。

純合三體型占異常核型的59.2%,該結(jié)果與其他報(bào)道一致［9-11］。導(dǎo)致染色體三體的主要原因是生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)染色體出現(xiàn)不分離。筆者發(fā)現(xiàn)了除1 號(hào)染色體外的所有常染色體三體型。出現(xiàn)頻率最高的三種三體型依次是16 號(hào)三體（也被稱作“流產(chǎn)染色體”）,22 三體,15 三體。出現(xiàn)頻率最低的三種三體型依次是4 號(hào)三體（1 例）,19 號(hào)三體（1 例）,5 號(hào)三體（2 例）。其他研究報(bào)道中,1 號(hào)和19 號(hào)染色體三體的頻率也是最低的。JENDERNY［12］的390 例研究和DU［13］的781 例研究中均未發(fā)現(xiàn)1 號(hào)和19 號(hào)染色體三體型。一項(xiàng)包含5 555 例的大樣本研究也未發(fā)現(xiàn)1 號(hào)染色體三體［14］。PYLYP［15］的研究報(bào)道了1 號(hào)染色體三體,但其數(shù)量及母親年齡、孕周均沒有描述。為什么這兩條特定染色體三體出現(xiàn)頻率極低？PELLESTOR［16］的研究結(jié)果顯示大號(hào)染色體不分離的幾率很低,這或許可以解釋為什么1 號(hào)染色體三體出現(xiàn)頻率極低。此外,目前的研究表明1 號(hào)染色體所承載的基因十分密集［17-18］,19 號(hào)是所有染色體中基因最密集的染色體［19］,這兩條染色體的三體將導(dǎo)致嚴(yán)重的遺傳不平衡,可能是極早期流產(chǎn)的遺傳因素,但極早期流產(chǎn)很難取材進(jìn)行遺傳學(xué)分析。復(fù)合三體型占所有異常結(jié)果的4.4%。并沒有發(fā)現(xiàn)特殊組合的三體型,說明復(fù)合三體型中所涉及的兩條染色體的組合都是隨機(jī)的。

第二大類型的絨毛染色體異常是三倍體。據(jù)報(bào)道,三倍體占所有臨床妊娠的2%～3%,但超過99%的胎兒會(huì)在孕早期或孕中期丟失,妊娠至16周的胎兒中大概只有1/30 000 的概率是三倍體［20］。而WICK［21］在2003 年發(fā)表的文章報(bào)道他們中心一年內(nèi)發(fā)現(xiàn)了4 例孕中期才被診斷出的三倍體胎兒,我國(guó)也有數(shù)例類似報(bào)道［22-24］,說明某些三倍體可能存活時(shí)間更長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)34 例流產(chǎn)絨毛染色體結(jié)果為三倍體,占所有異常結(jié)果的6.5%。國(guó)外的研究表明父源性的三倍體遠(yuǎn)高于母源性的［25-26］,國(guó)內(nèi)對(duì)這方面的研究報(bào)道極少,我們將在以后的工作中開展這方面的研究。

X 單體占所有檢測(cè)樣本的5.4%,占異常樣本的8.8%。該頻率在各個(gè)研究報(bào)道中比較穩(wěn)定。這可能是由于胎兒患X 單體的風(fēng)險(xiǎn)不受母親年齡的影響,而是由父源性性染色體的丟失導(dǎo)致的［27］。純合常染色體單體的報(bào)道主要集中在13 號(hào),15 號(hào)和21 號(hào)染色體,其中,報(bào)道最多的是21 號(hào)染色體單體。JENDERNY［12］報(bào)道了2 例純合性21 號(hào)染色體單體和1 例嵌合型21 號(hào)染色體單體,SHEARER［14］報(bào)道了1 例13 號(hào)染色體單體,1 例15 號(hào)染色體單體和11 例21 號(hào)染色體單體。筆者的研究未發(fā)現(xiàn)純合常染色體單體,發(fā)現(xiàn)1 例嵌合型22 號(hào)染色體單體,即45,XN,-22/46,XN。我們注意到,常染色體單體中所涉及的13,15,21 和22 號(hào)染色體,在三體型中發(fā)生率也較高,其發(fā)生機(jī)制還不清楚,有待于進(jìn)一步的探究。

CNVs 在人類基因組中是普遍存在的,盡管大多數(shù)都是良性的或者意義未明的,仍有相當(dāng)數(shù)量的染色體拷貝數(shù)變異與人類疾病密不可分,包括數(shù)百種微缺失微重復(fù)綜合征,智力缺陷,自閉癥,精神分裂癥等［28-31］。本研究共檢出染色體拷貝數(shù)變異65 例,24 例為明確致病性變異。結(jié)果表明,染色體拷貝數(shù)變異對(duì)孕早期流產(chǎn)的影響為4.6%（24/520）,而這部分畸變無法被傳統(tǒng)檢測(cè)方法識(shí)別。1 例絨毛染色體結(jié)果為1 號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端缺失16.68 Mb,10 號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端重復(fù)16.32 Mb。該結(jié)果提示其雙親之一可能為1 號(hào)和10 號(hào)染色體平衡易位攜帶者。夫妻雙方在外院染色體檢查結(jié)果顯示正常,筆者懷疑其可能被漏診,因此本院再次做高分辨染色體檢查。結(jié)果顯示,女方染色體結(jié)果為46,XX,男方染色體結(jié)果為46,XY,t（1；10）（q41；q25.1）。因此,絨毛染色體拷貝數(shù)檢測(cè)不僅可以明確流產(chǎn)原因,還可對(duì)父母染色體異常有所提示。如果絨毛染色體涉及到兩條染色體異常,一條片段重復(fù),一條片段缺失,其父母可能為平衡易位攜帶者；如果同一條染色體同時(shí)存在缺失和重復(fù),其父母可能為倒位攜帶者。染色體異?；颊咴俅稳焉飼r(shí),應(yīng)告知其自然受孕時(shí)胚胎染色體異常的概率,必要時(shí),建議其進(jìn)行三代試管。

綜上所述,絨毛染色體異常仍然是導(dǎo)致孕早期自然流產(chǎn)的主要原因,異常率高達(dá)61.3%。高通量測(cè)序是檢測(cè)絨毛染色體的有力工具,可檢出4.6%染色體拷貝數(shù)變異。應(yīng)重視流產(chǎn)絨毛染色體檢查,以明確流產(chǎn)原因,指導(dǎo)下次妊娠,并為遺傳咨詢提供有用的信息。