王磊，劉潔，黃偉

（中南大學湘雅醫(yī)院 1.腫瘤科 3.癌變機理與靶向治療研究室，湖南 長沙 410008；2.中南大學腫瘤研究所，湖南 長沙 410008；4.湖南省長沙市中心醫(yī)院 病理科，湖南 長沙 410004）

結直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均位居惡性腫瘤的前列[1-2]。隨著經濟的飛速發(fā)展和物質生活水平的提高，我國人民群眾的生活習慣及飲食結構的發(fā)生了很大改變，導致結直腸癌等西方國家高發(fā)的消化系統(tǒng)腫瘤在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且中青年的發(fā)病占比上升趨勢明顯[3-4]。根據(jù)2018國家癌癥中心公布的最新全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結直腸癌的發(fā)病率位列第三，病死率位列第五，且30歲以上人群的發(fā)病率快速增高。隨著基礎研究的深入、積累和轉化，結直腸癌的臨床診斷和治療取得了較為顯著的提高，結直腸癌患者，尤其是早期患者的5年生存率及荷瘤生活質量有了較大提升[5-6]。但整體來看，結直腸癌的早診率和治療水平仍有待進一步提升。因此，深入研究結直腸癌的發(fā)病機理，開發(fā)和鑒定結直腸癌早期診斷標志物和治療靶點是進一步提升結直腸癌臨床療效有效方式。

羧基酯脂肪酶（carboxyl ester lipase，CEL）是由胰島濾泡細胞分泌并進入消化道，也可以由泌乳的乳腺分泌進入乳汁，參與膽固醇、甘油脂、脂溶性維生素脂等脂質消化和吸收的脂肪酶，可促進乳糜微滴在腸道的生成[7-9]。CEL蛋白包含753個氨基酸，分子量為79 kD，其編碼基因位于9q34.13，長度約為10 kb，包含11個外顯子和10個內含子。CEL基因的第11號外顯子富含可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（variable-number tandem repeat，VNTR），通常為11～21個。VNTR的多態(tài)性是重要的遺傳標記，與CEL的功能可能存在相關性[10-11]。目前，已證實CEL的多態(tài)性/突變與動脈粥樣硬化、糖尿病及胰腺炎等病理過程密切相關[12-14]。隨著轉錄組測序數(shù)據(jù)的完善，CEL也被證實在腫瘤中存在高表達，提示其在多種腫瘤、尤其在消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能扮演了重要作用[11,15-16]。因此，本文研究了CEL在結直腸癌中的表達情況，并利用細胞模型對CEL在結直腸癌中的基本生物學功能進行了初步探討，為CEL在結直腸癌中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人結直腸癌細胞系SW620、SW480、HCT116和人正常結腸上皮細胞NCM460均為本實驗室保存。RPIM-1640培養(yǎng)基為GE公司HyClone品牌，胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自于以色列BI公司。RNAsimple總RNA提取試劑盒（DP419），F(xiàn)astKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑（KR118），SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（FP205）均購自北京天根生化科技有限公司。CEL抗體和β-actin抗體購買于武漢愛博泰克生物科技有限公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。CEL siRNA轉染試劑盒（含對照盒轉染試劑）購于廣州銳博生物科技有限公司。蛋白快速裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司。CCK-8、SDS-PAGE膠等試劑購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 臨床標本

56對結直腸癌標本及癌旁標本收集于2017年11月—2019年2月期間在長沙市中心醫(yī)院普通外科住院的手術初診患者，且均未接受放療和化療等治療。其中男30例，女26例；年齡25～65歲，平均年齡（48.42±8.24）歲，其中無轉移患者38例，轉移患者18例。所有標本均一分為二，一部分于液氮中凍存，用于RNA抽提，一部分于福爾馬林中固定，用于后續(xù)制作石蠟切片。所有標本均經病理科確認。所有標本收集前，均簽署了患者知情同意書，并獲得了長沙市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.3 方法

1.3.1 數(shù)據(jù)庫分析UALCAN數(shù)據(jù)庫整合了TCGA的基因表達數(shù)據(jù)和啟動子甲基化數(shù)據(jù)[17]。GEPIA數(shù)據(jù)庫除了整合了TCGA數(shù)據(jù)外，還包含了GTEx中的數(shù)據(jù)，具有更多的正常樣本量[18]。本文利用UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu）和GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）數(shù)據(jù)庫分析CEL在結直腸癌中的表達情況和啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)情況。

1.3.2 免疫組織化學實驗按筆者以往方法[19]和試劑盒說明，進行免疫組化操作，簡述如下。石蠟切片標本60℃熔蠟1 h，二甲苯脫蠟2次（3 min/次）梯度酒精脫水（100%→100%→95%→85%→75%，3 min/次），自來水水化1 min。切片隨后進行高壓抗原修復(檸檬酸鈉)、內源性過氧化物酶去除、血清封閉、CEL一抗（稀釋度：1:100）4℃過夜孵育、生物素標記二抗工作液孵育、HRP 標記的鏈霉親和素孵育、DAB 顯色、復染、脫水透明及中性樹膠封片后，于正立顯微鏡下觀察。根據(jù)染色強度和染色面積進行定量分析，無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分；陽性細胞比例≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；兩者得分之積為最終得分，分數(shù)≥4分為高表達，＜4分為低表達[19-21]。

1.3.3 細胞培養(yǎng)所有細胞的培養(yǎng)基配方均為包含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞匯合度達到70%～80%時，進行消化，傳代，接種細胞等操作，在良好的細胞狀態(tài)下進行相關實驗，保證結果的有效性。

1.3.4 siRNA轉染按照已發(fā)表文章進行轉染操作，簡述如下[22]。轉染前1 d，將SW620 細胞按2×105/孔的密度接種于6孔板中，保證轉染前細胞匯合度在30%～40% 左右。根據(jù)siRNA 轉染試劑盒的說明進行轉染操作，siCEL和siRNA 陰性對照序列（siNC）的轉染終濃度的100 nmol/L，轉染6 h后，更換含血清的新鮮培養(yǎng)基。siCEL和siNC 均購買自廣州銳博生物科技有限公司，siCEL序列為：5'-CCC GTT ATG ATCTGG ATCTAT-3'，siNC 序列為公司贈送，出于商業(yè)保密，未提供具體序列。

1.3.5 總RNA抽提及qPCR檢測按筆者已發(fā)表的論文[22]和試劑盒說明，抽提結直腸癌組織和細胞的總RNA和進行逆轉錄。利用SuperReal PreMix Plus 試劑，參照說明，配制qPCR 體系，利用ABI 7900 熒光定量PCR 儀運行PCR 操作，檢測CEL在結直腸癌組織和細胞中的相對表達水平，利用2-ΔΔCt法進行相對定量。qPCR 引物如下：CEL上游引物5'-TGG GTG ACT CTG TGG ACA TCT-3'，下游引物5'-GCA GGC ATCTCT TCT TGA AGT T-3'，產物大小129 bp；GAPDH 上游引物5'-CTG GGCTAC ACT GAG CAC C-3'，下游引物5'-AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3'，產物大小101 bp。

1.3.6 細胞總蛋白提取及Westernblot 按文獻[19]方法進行相關操作。簡述如下，待裂解細胞經PBS 洗滌后，甩干殘余后，按照1×106個細胞加入100 μL 蛋白裂解液的比例，于冰上裂解蛋白 15 min，收集蛋白，超聲處理后，經14 000 r/min離心，取蛋白上清保存，分裝包裝。選取10 μL 蛋白進行蛋白濃度測定，具體步驟參照說明書。蛋白按比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5 min 變性，冷卻后以30 μg/孔上樣，經12%的SDS-PAGE 電泳分離后，利用濕轉法將蛋白轉印至PVDF 膜后，經5%脫脂牛奶封閉，CEL 一抗孵育，TBST洗滌，二抗孵育，TBST洗滌后，利用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進行化學發(fā)光。

1.3.7 CCK-8分析根據(jù)已發(fā)表的論文和試劑說明書進行CCK-8 實驗[19]。將處于對數(shù)生長期的敲低CEL表達的SW620細胞和對照細胞，按1 000個 細胞/孔的密度接種于96孔板，每隔24 h，連續(xù)4次，分別取5個孔，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h后，利用Bio-Tek 酶標儀，測量450 nm 波長下，各孔的吸光值，扣除空白本底后，繪制生長曲線。

1.3.8 平板克隆形成實驗按筆者以往方法[19]進行平板克隆形成實驗，簡述如下：將處于對數(shù)生長期的敲低CEL表達的SW620 細胞和對照細胞，按每孔1 000個細胞，接種于6 孔板，每種細胞設置3個復孔。細胞連續(xù)培養(yǎng)8 d后，利用甲醇固定15 min，隨后利用0.5%結晶紫染色15 min，經自來水漂去除游離染色液后，計算各孔的克隆數(shù)目（藍色）。于倒置顯微鏡鏡下觀察每個克隆的細胞數(shù)目，＞50個細胞的克隆，計算為1個有效 克隆。

1.3.9 Transwell小室遷移和侵襲實驗 按文獻[19]方法進行Transwell 小室遷移和侵襲實驗，簡述如下。消化和收集處于對數(shù)生長期的CEL表達敲低的SW620 細胞和對照細胞，利用RPIM-1640培養(yǎng)基(不含血清) 重懸細胞，調整細胞密度至50 000 細胞/mL，分別于預鋪有Matrigel和未鋪Matrigel的Transwell小室中加入500 μL細胞懸液，使細胞總數(shù)為25 000個。同時，在下室孔中（24孔板）加入750 μL 含15%FBS的RPMI-1640的完全培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出，經甲醇固定15 min，0.5%結晶紫染色15 min，經自來水漂洗后，利用棉簽小心刮除Transwell 小室上層的細胞，于顯微鏡下觀察細胞穿過情況，隨機選取5個視野，計算穿過細胞的平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理

利用SPSS statistics 20.0和Graphpad prism 6.0進行統(tǒng)計學分析和作圖。平均OD值、平均克隆數(shù)、平均細胞數(shù)等計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較利用χ2檢驗或Fisher精確檢驗（n＜5）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 在線數(shù)據(jù)庫分析

為了初步分析CEL在結直腸癌中的表達水平，利用UALCAN和GEPIA在線工具分析CEL在結直腸癌和正常組織中的表達差異UALCAN數(shù)據(jù)庫結果顯示，CEL在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于正常結直腸組織（P＜0.001）（圖1A）。GEPIA數(shù)據(jù)庫同樣顯示，CEL在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于正常結直腸組織（P＜0.05）（圖1B）。另外UALCAN數(shù)據(jù)庫甲基化分析結果顯示，結直腸癌組織CEL的啟動子區(qū)甲基化水平明顯低于正常結直腸組織（P＜0.001）（圖2A-B），提示啟動子區(qū)的低甲基化可能是CEL在結直腸癌中高表達的重要原因。

圖1 在線數(shù)據(jù)庫分析CEL在結直腸癌中的表達 A：UALCAN 結果顯示，CEL在結腸癌和直腸癌中的表達水平明顯高于正常組織；B：GEPIA 結果顯示，CEL在結腸癌和直腸癌中的表達明顯高于正常組織Figure1 Analysis of the expression level of CEL in colorectal cancer using online databases A:UALCAN results showing that the expression level of CEL in colon cancer and rectal cancer are significantly higher than those in normal tissues;B:GEPIA results showing that the expression of CEL in colon cancer and rectal cancer are significantly higher than those in normal tissues

圖2 利用UALCAN分析CEL在結直腸癌中的啟動子甲基化水平 A：結腸癌中CEL1 啟動子區(qū)的甲基化水平明顯低于正常組織；B：直腸癌中CEL1 啟動子區(qū)的甲基化水平明顯低于正常組織Figure2 Analysis of the promoter methylation level of CEL in colorectal cancer using UALCAN A:The promoter methylation level of the CEL1 region in colon cancer is significantly lower than that in normal tissues;B:The promoter methylation level of the CEL1 region in rectal cancer is significantly lower than that in normal tissues

2.2 CEL在結直腸癌組織和細胞中的表達

為了驗證在線分析的相關結果，在收集的結直腸癌組織及培養(yǎng)的結直腸癌細胞系中檢測了CEL的表達水平。qPCR結果顯示，CEL在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于其在癌旁組織中的表達水平（P＜0.001）（圖3A）。免疫組化結果顯示，CEL蛋白在癌旁組織中低表達，在結直腸癌組織中高表達，且在轉移癌中表達水平更高，其表達主要分布于胞漿和胞膜（圖3B）。qPCR及Western blot結果也證實，CEL在SW620等結直腸癌細胞系中的表達水平和蛋白水平明顯高于永生化的正常腸上皮細胞NCM460（P＜0.01；P＜0.001）（圖3C）。

2.3 敲低CEL表達對結直腸癌細胞的生長和增殖的影響

為了進一步研究CEL在結直腸癌中的功能，選取CEL表達水平較高的SW620細胞作為模型，進行了后續(xù)的功能研究。利用脂質體轉染方法，將特異性靶向CEL的siRNA轉入CEL高表達的SW620細胞系，從而瞬時敲低CEL的表達。Western blot結果顯示，SW620中CEL的表達被siRNA明顯抑制，表明瞬時敲低成功（圖4A）。隨后，利用CCK-8和平板克隆形成實驗分析敲低CEL對SW620生長和增殖的影響。結果顯示，與對照組細胞比較，敲低CEL表達后，SW620的生長和增殖能力明顯降低（P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001）（圖4B-C）。

圖3 CEL在結直腸癌組織和細胞中表達的檢測結果 A：qPCR結果顯示，CEL在結直腸癌中的表達顯著高于正常組織；B：免疫組化結果顯示，CEL在結直腸癌組織中的水平高于正常組織，且轉移癌中的水平高于無轉移癌（×200）；C：qPCR和Western blot 結果顯示，CEL在結直腸癌細胞系中的水平明顯高于正常結腸上皮細胞Figure3 Results of determinations of CEL expression in colorectal cancer tissues and cells A:qPCR results showing that the expression of CEL in colorectal cancer is significantly higher than that in normal tissues;B:The results of immunohistochemistry showing that the level of CEL in colorectal cancer tissue is higher than that in normal tissue,and the level in metastatic cancer is higher than that in non-metastatic cancer;C:Results of qPCR and Western blot showing that the level of CEL in colorectal cancer cell lines is significantly higher than that in normal colonic epithelial cells

圖4 CEL對結直腸癌細胞生長和增殖的作用 A：Western blot 顯示，SW620 中CEL的表達被顯著敲低；B：CCK-8 顯示，敲低CEL表達，SW620的生長被明顯抑制；C：克隆形成顯示，敲低CEL表達，SW620的增殖被明顯抑制Figure4 Effects of CEL on the growth and proliferation of colorectal cancer cells A:Western blot showing that the expression of CEL is significantly knocked down in SW620;B:CCK-8 assay showing that CEL knockdown significantly inhibits the growth of SW620 cells;C:Colony formation showing that CEL knockdown notably inhibits the proliferation of SW620 cells

2.4 敲低CEL表達對結直腸癌細胞遷移和侵襲的影響

免疫組化結果提示，CEL在轉移的結直腸癌組織中表達更高，提示CEL與結直腸癌細胞的遷移和侵襲相關。因此，進一步分析CEL表達水平改變對SW620細胞遷移和侵襲能力的影響。Tranwell遷移和侵襲實驗結果顯示，敲低CEL表達后，SW620細胞的遷移和侵襲能力明顯降低（P＜0.001）（圖5A-B）。

圖5 CEL表達對結直腸癌細胞遷移和侵襲的作用 A：Transwell 遷移實驗顯示，敲低CEL表達，SW620的遷移能力被明顯抑制；B：Transwell 侵襲實驗顯示，敲低CEL表達，SW620的侵襲能力被明顯抑制Figure5 Effects of CEL on the migration and invasion of colorectal cancer cells A:Transwell migration experiment showing that CEL knockdown significantly inhibits the migration ability of SW620 cells;B:Transwell invasion experiment showing that CEL knockdown remarkably suppresses the invasion ability of SW620 cells

3 討 論

盡管早期篩查及靶向及免疫治療等手段的應用，提高了結直腸癌的早期診斷率和治療水平，但其發(fā)病率和病死率仍位居前列，表明結直腸癌的發(fā)病機理仍有待進一步揭示。篩選和鑒定結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵分子，不僅可以揭示和完善發(fā)病機理，還可以為臨床診斷和治療提供候選靶點[23]。隨著二代高通量測序技術的問世和生物信息學的發(fā)展，促進了包含各種組織、細胞及體液等多樣本的高通量測序數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫平臺的飛速發(fā)展。尤其在腫瘤研究領域，基于TCGA，GEO及Oncomine等在線數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析和挖掘，成為腫瘤關鍵分子的篩選、鑒定和驗證的重要工具。本研究基于TCGA及GTEx等數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，利用GEPIA和UALCAN等在線分析工具篩選，發(fā)現(xiàn)CEL在結直腸癌中高表達，并在臨床標本和細胞系中進一步驗證這一結論，提示CEL可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

眾多研究證實，CEL基因單點突變（缺失或插入）、VNTR長度多態(tài)性、拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）等遺傳變異與青少年發(fā)病的成人型糖尿病、I型和II型糖尿病、慢性胰腺炎、酒精性胰腺炎、胰腺外分泌綜合征及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生密切相關[8-10,12,14]。但是CEL在腫瘤中的表達和功能中的研究相對較少。Dalva等[11]分別分析了包含非酒精性慢性胰腺炎和胰腺癌的德國家系和一個包含462例胰腺癌和882例正常樣本的隊列中，CEL的CNVs和VNTR多態(tài)性與腫瘤的關系，結果顯示，CEL CNVs和VNTR多態(tài)性在腫瘤組和對照組中差異無統(tǒng)計學意義。Shindo 等[24]的研究結果也顯示，CEL-HYB（CEL的雜合性等位基因）的攜帶率在胰腺導管腺癌組和對照組差異無統(tǒng)計學意義。另外最近的研究證實，CEL在乳腺癌中高表達，CEL高表達患者的預后更差[16]。目前，還未見CEL遺傳變異與結腸癌發(fā)生發(fā)展的報道，從TCGA等數(shù)據(jù)庫獲取的信息顯示，CEL突變及CNVs在結直腸癌中的總占比在1%左右，且未發(fā)現(xiàn)與結直腸癌發(fā)生顯著相關的熱點。因此，基因突變等遺傳變異在CEL腫瘤向的功能中作用較小。

癌基因的異?；罨鸵职┗虻氖Щ钍悄[瘤發(fā)生和進展的驅動因素，篩選和鑒定新的癌基因和抑癌基因是全面解析腫瘤發(fā)生機制的重要環(huán)節(jié)。EGFR、Ras、p53等腫瘤關鍵分子的發(fā)現(xiàn)，極大地促進腫瘤基礎和臨床的進步，但仍有眾多問題等待解決，鑒定和解析更多腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的關鍵基因的功能意義重大[25-27]。本研究經過在線數(shù)據(jù)庫分析和本地樣本驗證，首次證實CEL在結直腸癌中高表達，提示CEL在結直腸癌中可能發(fā)揮了重要作用。DNA甲基化等表觀遺傳因素在基因表達調控中發(fā)揮了重要作用，啟動子區(qū)低甲基化和高甲基化分別是癌基因高表達和抑癌基因失活的常見機制[28]?；谝延屑谆瘻y序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織中CEL啟動子區(qū)的甲基化轉態(tài)顯著低于正常黏膜組織，提示啟動子低甲基化是CEL在結直腸癌中高表達的重要機制。

持續(xù)的增殖信號、逃避生長抑制、抵抗細胞死亡、誘導血管生成、組織和浸潤轉移、無限復制、能量代謝異常、基因組不穩(wěn)定和突變、免疫逃逸及促瘤炎癥等是腫瘤的十大基本特征[29]。從最終效應來看，十大特征的結果是腫瘤的快速增殖和侵襲轉移[29-30]。因此，本研究進一步分析了CEL表達水平對結直腸癌生長和侵襲能力的影響。敲低CEL表達后，結直腸癌細胞的生長、增殖和侵襲能力顯著降低，表明CEL高表達能促進結直腸癌細胞的生長和侵襲，但是其具體機制仍有待進一步揭示。從理論上分析，結直腸癌中CEL高表達和分泌，可促進腸道等微環(huán)境中脂類等物質的快速消化和吸收，為腫瘤的快速生長和侵襲提供物質和能量。

綜上所述，本研究首次驗證和揭示了CEL在結直腸癌中的表達和基本功能，表明CEL可能是結直腸癌發(fā)生和發(fā)展中重要的正調控因子，深入CEL在結直腸癌中作用、分子機制和臨床意義有望為結直腸癌的診斷、治療和預后判斷提供新的靶標。