周新童，黨勝春

（1.蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院 普通外科，江蘇 張家港 215600；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

胃癌是全球五大惡性腫瘤之一，其病死率在所有癌癥中居第2位[1]。中國是胃癌的高發(fā)病區(qū)，發(fā)病患者數(shù)大約占全世界的一半[2]。由于其發(fā)病隱匿，病情進展較快，5年生存率25%～30%[3]。隨著近幾年診斷及治療水平的進步，早期患者的生存率已經(jīng)得到明顯提高，但進展期胃癌患者生存率依舊很低[4-6]。因此，建立良好的診斷和預(yù)后篩選評估體系，對胃癌的診治尤為重要。

在過去的幾十年里，人們在胃癌的分子機制研究方面取得了非常大的突破[7-9]。然而，目前尚無能用于胃癌治療及預(yù)后評估的分子標志物。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的RNA，其本身并不具備編碼蛋白質(zhì)的功能[10]。近年來研究顯示，lncRNA在基因組中廣泛分布，參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾及基因表達等重要生理過程[11-13]。lncRNA在腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估方面的價值也逐漸的被挖掘出來[14-16]。

近幾年來，越來越多的人嘗試利用公共數(shù)據(jù)庫，比如從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中獲得大樣本數(shù)據(jù)進行研究[17-19]。然而，單一的TCGA數(shù)據(jù)庫使用存在著一些問題，比如正常對照樣本的匱乏（TCGA中僅有32例胃癌樣本存在癌旁對照信息）。此外，筆者發(fā)現(xiàn)，基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫（Genotype-Tissue Expression，GTEx）中保存有大量可作為正常對照的樣本信息。

本研究擬將TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌患者和GTEx數(shù)據(jù)庫中正常人胃黏膜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合起來，構(gòu)建一個由10種lncRNA組成的模型（10-lncRNA預(yù)后模型），作為一種新的判斷胃癌患者預(yù)后狀態(tài)的指標。隨后，通過基因表達匯編數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO），引入一個獨立的數(shù)據(jù)集（GSE62254），驗證該預(yù)后模型的穩(wěn)健性[20]。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

從TCGA官方網(wǎng)站（https://portal.gdc.cancer.gov/repository）下載獲取胃癌的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集，其中胃癌患者的樣本375例，對照組樣本32例，同時下載相應(yīng)的臨床資料。在進行預(yù)后分析及研究風(fēng)險值（Risk Score）與臨床資料的關(guān)系時，剔除臨床信息不全的樣本，共剩余317例。從GTEx官方網(wǎng)站（https://gtexportal.org）下載獲取正常人的胃黏膜樣本轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，共計194例。在篩選差異表達lncRNA時，將32例對照組樣本以及 194例正常胃黏膜樣本合并，作為對照組與375例癌組織樣本進行差異分析。從GEO官方網(wǎng)站（https://ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載獲取GSE62254數(shù)據(jù)集，共計300例，同獲取該數(shù)據(jù)集的臨床樣本文件。

1.2 數(shù)據(jù)處理

將下載好的TCGA和GTEx的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)合并，取與GSE62254共有的LncRNA，共計1250個。最終獲得的TCGA+GTEx矩陣有1250行×601列（lncRNA×樣本名），此矩陣將作為建模組用于后續(xù)構(gòu)建預(yù)后模型；GEO矩陣有1250行×300列，此矩陣將作為驗證組用于對模型進行驗證。

1.3 篩選差異表達lncRNA

首先通過R軟件中的edgeR包對數(shù)據(jù)進行標準化，并使用sva包的combat函數(shù)對數(shù)據(jù)進行批次校正，之后使用經(jīng)驗貝葉斯估計，計算癌組織和對照組樣本的差異顯著性。通過Benjamini &Hochberg方法對P值進行校正，篩選出差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞4，且校正后的P值（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.01的基因。

1.4 構(gòu)建預(yù)后模型

將上述篩選出的lncRNA與TCGA 下載的生存數(shù)據(jù)進行合并，首先采用單因素Cox回歸進行生存分析，篩選出P值＜0.05的lncRNA。隨后進行多因素Cox回歸分析，分析方法為向前-向后法，通過赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC），選出AIC值最小，即最優(yōu)化的預(yù)后模型[21-22]，并得到模型中各lncRNA的比例系數(shù)β，以此計算風(fēng)險值（risk score），計算公式為：Risk Score=β1X1+β2X2+…+βnXn，其中β表示各lncRNA相關(guān)系數(shù)，X表示lncRNA表達量。

根據(jù)計算出來的各個樣本風(fēng)險值，以中位數(shù)為界把胃癌患者分為高風(fēng)險及低風(fēng)險組，并且用R軟件中的pheatmap包將風(fēng)險值可視化。使用survivalROC包繪制時間依賴性ROC曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究所使用的數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計軟件為R軟件（版本3.4.0）和SPSS（版本19.0），各項分析均為雙側(cè)檢驗，所有統(tǒng)計檢驗結(jié)果的P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過單因素及多因素Cox回歸分析，篩選與胃癌預(yù)后獨立相關(guān)的危險因素。預(yù)后風(fēng)險值以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（IQR）]表示，其與臨床的相關(guān)性分析使用Wilcoxon秩和檢驗進行兩組間比較，多組間比較選用Kruskal-Wallis檢驗。生存分析結(jié)果通過Kaplan-Meier曲線來展示，差異顯著性采用Log-rank法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌lncRNA表達矩陣的建立、差異分析

合并后的實驗組（TCGA+GTEx）矩陣進行差異分析，共篩選出288個差異表達lncRNA（FDR＜ 0.01，|Log2FC|＞2），其中236個上調(diào)表達，52個下調(diào)表達，繪制火山圖，見圖1。

圖1 建模組（TCGA+GTEx）矩陣中的差異表達lncRNA（紅色代表上調(diào)lncRNA，綠色代表下調(diào)lncRNA）Figure1 The differentially expressed lncRNAs in modeling cohort (TCGA+GTEx) matrix (the red nodes presenting the up-regulated lncRNAs,and the green nodes indicating down-regulated lncRNAs)

2.2 預(yù)后模型的構(gòu)建

首先對上述的lncRNA進一步篩選，使用單因素Cox回歸分析，確定與胃癌患者的總體生存相關(guān)的28個lncRNA（均P＜0.05），用于預(yù)后模型的構(gòu)建。通過多因素Cox回歸分析來構(gòu)建模型，當納入的lncRNA個數(shù)為10個時，模型具有最小的AIC值：1 451.36，此時模型的擬合程度最優(yōu)。這10個lncRNA分別是MEG3（P=0.039）、DNAJC9-AS1（P=0.01）、ACTA2-AS1（P=0.122）、C15orf54（P=0.024）、LINC01210（P＜0.01）、OVAAL（P=0.078）、POU6F2-AS2（P=0.07）、ERICH3-AS1（P＜0.001）、LINC00326（P=0.084）、LINC01526（P=0.078）。最終預(yù)后模型：風(fēng)險值=（MEG3表達值×0.174）+（DNAJC9-AS1表達值×（-0.212））+（ACTA2-AS1表達值×0.112）+（C15orf54表達值×0.140）+（LINC01210表達值×（-0.178））+（OVAAL表達值×0.104）+（POU6F2-AS2表達值×0.076）+（ERICH3-AS1表達值×0.269）+（LINC00326表達值×0.098）+（LINC01526表達值×0.162）。在下文驗證組（GSE62254）中同樣依據(jù)此公式計算風(fēng)險值。

2.3 預(yù)后模型的風(fēng)險值評估

根據(jù)公式所計算出預(yù)后風(fēng)險值的中位數(shù)，將樣本分為高及低風(fēng)險組，并對結(jié)果進行可視化展示（圖2），同時，繪制高及低風(fēng)險組的Kaplan-Meier曲線，并進行Log-rank檢驗，分析顯示，高風(fēng)險組的總體生存率明顯低于低風(fēng)險組，高及低風(fēng)險組5年總體生存率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義[（18.6±6.2）% vs.（57.6±6.4）%，P＜0.001]（圖3A）。另外，高風(fēng)險組無病生存率明顯低于低風(fēng)險組，高及低風(fēng)險組5年無病生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（34.0±8.8）% vs.（61.4±6.6）%，P＜0.01]（圖3B）。繪制時間依賴性ROC曲線（圖4），結(jié)果顯示，該預(yù)后模型的AUC（0.700）明顯大于性別（0.542）、年齡（0.586）、T分期（0.564）、N分期（0.576）、M分期（0.532）、TNM分期（0.606）、分化程度（0.563）等指標，提示該預(yù)后模型對于評估胃癌患者的預(yù)后有一定準確性。

圖3 建模組中高及低風(fēng)險組患者Kaplan-Meier 曲線 A：總體生存曲線；B：無病生存率的曲線Figure3 Kaplan-Meier curves for patients in high-risk and low-risk groups of modeling cohort A:Overall survival curves;B:Diseasefree survival curves

圖4 各種臨床指標以及預(yù)后風(fēng)險值的時間依賴性ROC曲線以及AUC值Figure4 Time-dependent ROC curves and AUC values for various clinical characteristics and risk score

2.4 篩選影響胃癌生存預(yù)后的獨立危險因素

通過單因素Cox回歸分析尋找與胃癌患者生存預(yù)后有關(guān)的因素，并繪制森林圖，結(jié)果顯示年齡較高（＞60歲）、腫瘤T分期較晚、N分期較晚、TNM分期較晚、風(fēng)險值較高的患者預(yù)后較差（均P＜0.05）（圖5A）。隨后進一步將上述陽性指標納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示年齡和風(fēng)險值是胃癌患者的獨立危險因素（均P＜0.001）（圖5B）。

2.5 預(yù)后模型與臨床因素的關(guān)系

分析顯示，預(yù)后風(fēng)險值與胃癌患者的T分期、腫瘤分化程度明顯有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、N分期、M分期、TNM分期之間無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

圖5 各臨床指標以及預(yù)后風(fēng)險值對總體生存時間影響的森林圖 A：單因素Cox回歸分析；B：多因素Cox回歸分析Figure5 Forest plots of the impact of clinical characteristics and risk score on overall survival time A:Univariate Cox regression analysis;B:Multivariate Cox regression analysis

表1 胃癌的臨床病理特征與風(fēng)險值的關(guān)系Table1 Relations of clinicopathologic features with risk score in gastric cancer

2.6 預(yù)后模型的驗證

按照公式計算驗證組（GSE62254）中的風(fēng)險值，并與其臨床資料合并，繪制Kaplan-Meier曲線，分析顯示，高風(fēng)險組的總體生存率明顯低于低風(fēng)險組，高及低風(fēng)險組5年總體生存率存在明顯差異[（45.3±4.0）% vs.（59.2±4.0）%，P＜0.01]（圖6A）。另外，高風(fēng)險組無病生存率顯著低于低風(fēng)險組，高及低風(fēng)險組5年無病生存率存在明顯差異[（42.2±4.4）% vs.（60.1±4.5）%，P＜0.01]（圖6B）。隨后進行的單因素（P＜0.01）和多因素（P=0.019）Cox回歸分析表明，風(fēng)險值仍為獨立預(yù)后因素。驗證結(jié)果提示，該預(yù)后模型在不同環(huán)境下均具有良好的預(yù)測效能。

圖6 驗證組（GSE62254）中高及低風(fēng)險組患者Kaplan-Meier 曲線 A：總體生存曲線；B：無病生存曲線Figure6 Kaplan-Meier curves for patients in high-and low-risk groups of the validation cohort (GSE62254) A:Overall survival curves;B:Disease-free survival curves

3 討 論

過去，人們一直認為lnc RNA是轉(zhuǎn)錄過程中的廢棄產(chǎn)物。隨著研究的深入，lncRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)參與許多基本的生物學(xué)過程，例如調(diào)節(jié)細胞周期、細胞凋亡和DNA損傷修復(fù)[23-24]。為了探索可用于胃癌的預(yù)后風(fēng)險判斷的lncRNA，我們通過挖掘高通量測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建出能夠用于評估患者生存狀態(tài)的10-lncRNA預(yù)后模型。

通過使用10-lncRNA預(yù)后模型，可以觀察到高及低風(fēng)險的患者的生存曲線存在著明顯的分離。與高風(fēng)險評分患者相比，低風(fēng)險評分患者的生存時間顯著延長。單因素和多因素Cox回歸分析顯示，10-lncRNA預(yù)后模型與疾病預(yù)后獨立相關(guān)。風(fēng)險值與T分期及腫瘤分化程度有關(guān)，而與N分期及M分期無關(guān)，提示10-lncRNA預(yù)后模型能夠用于判斷患者預(yù)后的具體機制可能涉及腫瘤的生長及分化，而非遷移及侵襲等生理學(xué)過程。

關(guān)于這10種lnc RNA的特征，其中5個（DNA J 9-AS1、C15orf54、ERICH3-AS1、LINC00326及LINC01526）迄今為止還沒有相關(guān)的研究報道，筆者首先報道其表達水平與預(yù)后之間關(guān)系的研究。另外5個lncRNA，其中母體表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）在不同的癌細胞（例如乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌及胃癌）中通過調(diào)節(jié)主要的抑癌基因P53和Rb來發(fā)揮抗腫瘤的作用[25]。而ACTA2-AS1的一個轉(zhuǎn)錄本的低表達顯著促進了肝癌細胞的增殖、細胞周期進程、遷移和侵襲[26]。在卵巢癌中，LINC01210的較高表達與卵巢癌患者較差的總體生存和無病生存相關(guān)[27]。在大腸癌和黑色素瘤中，OVAAL與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（STK3）的相互作用增強了STK3與RAF-1之間的結(jié)合，最終導(dǎo)致RAF/MEK/ERK通路的激活，從而促進了癌細胞的增殖和存活[28]。最后一個lncRNA，POU6F2-AS2參與了電離輻射后食管癌細胞DNA損傷修復(fù)并調(diào)節(jié)細胞的存活[29]，且在結(jié)腸癌中具有促進腫瘤增殖和耐藥的作用[30]。

目前，對于胃癌患者來說，仍然還未有能夠有效判斷預(yù)后的工具。如本研究所示，使用較少量的lncRNA（10個）便可以預(yù)測胃癌患者的預(yù)后，這為臨床醫(yī)生提供了寶貴而可行的參考。當然本研究還存在局限性，由于高通量測序數(shù)據(jù)具有一定的誤差及背景噪音[31]，本研究雖然在分析前已對數(shù)據(jù)進行標準化及批次校正，且通過獨立驗證組初步驗證了模型的穩(wěn)健性，但結(jié)果仍需臨床和基礎(chǔ)實驗來進一步的研究證實。

總之，本研究構(gòu)建了與胃癌患者生存相關(guān)的10-lncRNA預(yù)后模型，并對模型的預(yù)測效能進行了驗證。未來需要更多細胞、動物功能學(xué)實驗來探索這些lncRNA的作用。