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        gD糖蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD的構(gòu)建及其在Hela細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)

        2020-11-12 00:49:16何卓晶周寒鵬
        健康研究 2020年5期
        關(guān)鍵詞:真核糖蛋白皰疹病毒

        何卓晶,陶 薇,傅 婷,周寒鵬,洪 艷

        (杭州醫(yī)學(xué)院 生物工程研究所,浙江 杭州 310013)

        2型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 2, HSV-2)感染可引起皮膚水泡、潰瘍性病變及神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的并發(fā)癥,易傳播給易感的性伴侶、胎兒和新生兒[1],可增加感染人類免疫缺陷病毒的危險(xiǎn)[2-3]。HSV-2感染導(dǎo)致的生殖器皰疹是引起生殖器區(qū)域潰瘍的原因之一,可引起相關(guān)的公共健康問(wèn)題[4-5]。HSV-2初次感染期間,病毒即在骶神經(jīng)節(jié)中終身潛伏下來(lái),并能再次激活導(dǎo)致復(fù)發(fā)。目前,生殖器皰疹的標(biāo)準(zhǔn)治療和預(yù)防藥物為鳥(niǎo)苷類似物,如阿昔洛韋,伐昔洛韋,噴昔洛韋和泛昔洛韋。鳥(niǎo)苷類似物藥物能通過(guò)干擾HSV的DNA聚合酶而抑制病毒復(fù)制,但該類藥物需每日給藥以維持其抑制病毒復(fù)制的作用,且很多HSV毒株對(duì)該類抗病毒藥物產(chǎn)生了抗性[6]。疫苗是控制生殖器皰疹的另一有效策略,HSV-2病毒衣殼上的糖蛋白D(glycoprotein D, gD)具有較高的免疫原性,近年來(lái)逐漸成為單純皰疹病毒亞單位疫苗的研究熱點(diǎn)。本研究構(gòu)建gD糖蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD,并觀察其在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況,旨在為單純皰疹病毒亞單位疫苗的研究提供基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料與試劑 質(zhì)粒pcDNA3Kan為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含卡那霉素抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒載體,pcDNA3Kan-gD為本實(shí)驗(yàn)室保存的含有HSV-2糖蛋白gD基因的質(zhì)粒。Hela細(xì)胞、BALB/c小鼠抗HSV-2血清均為本單位生物工程所制備及保存。RNA抽提試劑盒購(gòu)自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司,限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、高保真DNA聚合酶均購(gòu)自Promage公司,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SuperFectinTMⅡ in Vrio DNA transfection Reagent試劑盒購(gòu)自上海普飛生物技術(shù)有限公司,高純度質(zhì)粒小提試劑盒、Goat Anti-Mouse IgG DylightTM448及Hochest 33258購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

        1.2 真核重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3Kan-gD的構(gòu)建根據(jù)HSV-2gD基因的編碼序列以及質(zhì)粒載體pcDNA3kan的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,在上下游引物的兩端分別添加EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn),上游引物P1:5’ATCGAATTCAACCACTAGTCGCCG 3’;下游引物P2:5’CGCTCGAGACTCCCTTTATGC 3’。從pcDNA3Kan-gD上通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取gD全長(zhǎng)序列基因片斷,大小為420 bp。然后用EcoRI和XhoI分別對(duì)真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3Kan及PCR擴(kuò)增得到的gD基因片斷進(jìn)行雙酶切。將酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆,獲得真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD。

        1.3 質(zhì)粒的提取與純化 將含真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD的E.coliBL21菌株和含pcDNA3Kan的E.coliBL21菌株分別于含卡那霉素(25 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜,次日使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒抽提并純化pcDNA3Kan質(zhì)粒和真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD,核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和A260/A280。

        1.4 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,于37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。

        1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞按照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行:于轉(zhuǎn)染前一天將Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一次,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%~80%融合度且生長(zhǎng)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前更換新鮮的完全培養(yǎng)基并孵育30~60 min。于1.5 mL無(wú)菌離心管中準(zhǔn)備以下溶液,溶液A:用不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基分別將0.188 μg、0.375 μg和0.750 μg(即1×、2×和4×)真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD稀釋至38 μL;溶液B:用不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基將2.25 μL SuperFectinTMⅡ試劑稀釋至38 μL;將溶液B加入到溶液A中并混勻,室溫孵育15 min。將SuperFectinTMⅡ/DNA混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板以混勻。5%CO2,37℃培養(yǎng)12 h后,更換新鮮的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,采用半定量RT-PCR技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)梯度轉(zhuǎn)染的pcDNA3Kan-gD重組質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況。

        1.6 半定量RT-PCR 傾去轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞的培養(yǎng)上清,用0.25%的胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞。按RNA抽提試劑盒使用說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA,提取的RNA溶于DEPC處理水中。按cDNA第一鏈合成試劑盒使用說(shuō)明完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并合成cDNA第一鏈后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。上游引物:5’GCGTGTTTACCACATTCAGCC 3’;下游引物:5’TCCGTCCAGTCGTTTATCTTCA 3’。β-actin的擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸2 min。上游引物:5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3’;下游引物:5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3’。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并采用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

        1.7 免疫熒光技術(shù) 消化梯度轉(zhuǎn)染(1×和4×)pcDNA3Kan-gD重組質(zhì)粒的Hela細(xì)胞進(jìn)入12孔板,待細(xì)胞貼壁,用PBS清洗3次,4%多聚甲醇固定30 min,PBS清洗;于37 ℃用含0.3% Triton的PBS處理30 min,PBS清洗3次;用含1%BSA的PBS封閉30 min后,PBS清洗1次;以BALB/c小鼠抗HSV-2血清(1∶100稀釋)作為一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,次日PBS清洗;以Goat Anti-Mouse IgG DylightTM488作為熒光二抗,37 ℃孵育1 h,PBS清洗;加入Hochest 33258染液染細(xì)胞核10 min,PBS清洗。采用熒光倒置顯微鏡(CKX41,日本OLYMPUS)觀察結(jié)果。

        2 結(jié)果

        2.1 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD的鑒定 將構(gòu)建完成的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD以限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切,產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在420 bp處顯示一條帶,大小與預(yù)期相符,見(jiàn)圖1。

        M:標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA;1:真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD;2:真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3Kan;3:通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取的gD全長(zhǎng)序列基因片斷;4:pcDNA3Kan-gD的EcoR I和Xho I雙酶切片段。圖1 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD的鑒定結(jié)果

        2.2 質(zhì)粒提純 將純化的質(zhì)粒用無(wú)菌蒸餾水定容至0.5 mL后,測(cè)定其濃度和純度。純化后的pcDNA3Kan-gD的濃度為0.16 μg/μL, A260/A280為1.703;純化后的pcDNA3Kan的濃度為0.14 μg/μL,A260/A280為1.718。

        2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后半定量RT-PCR結(jié)果 轉(zhuǎn)染pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞總RNA經(jīng)RT-PCR后擴(kuò)增出大小為420 bp的gD基因條帶,β-actin基因條帶大小為318 bp;分析條帶灰度值顯示,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的相對(duì)表達(dá)量(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與β-actin表達(dá)量的比值)與轉(zhuǎn)染倍數(shù)呈劑量依賴關(guān)系;見(jiàn)圖2。

        M:標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA;1:gD基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.188 μg,1×);2:gD基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.375 μg,2×);3:gD基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.750 μg,4×);4:β-actin基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.188 μg,1×);5:β-actin基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.375 μg,2×);6:β-actin基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.750 μg,4×);**P<0.01; *** P<0.001。圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后半定量RT-PCR結(jié)果

        2.4 免疫熒光技術(shù)分析結(jié)果 轉(zhuǎn)染pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,1×與4×轉(zhuǎn)染倍數(shù)的Hela細(xì)胞平均光密度比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖3。

        A:轉(zhuǎn)染1× pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞;B: 轉(zhuǎn)染4× pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞;***P<0.001。圖3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Hela細(xì)胞免疫熒光分析結(jié)果

        3 討論

        DNA疫苗通常由DNA質(zhì)粒構(gòu)建而成。當(dāng)DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入疫苗接種者后表達(dá)蛋白抗原,由此介導(dǎo)外源蛋白的內(nèi)源性生產(chǎn),包括其天然構(gòu)造和轉(zhuǎn)錄后適當(dāng)?shù)男揎?。早期研究[7]結(jié)果認(rèn)為,向哺乳動(dòng)物肌肉中直接注射攜帶真核基因的質(zhì)粒DNA,能誘導(dǎo)編碼蛋白的內(nèi)源性表達(dá)及抗編碼蛋白的特異性免疫反應(yīng),由此奠定了DNA疫苗的發(fā)展基礎(chǔ)。這種以DNA為基礎(chǔ)的免疫實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)展為保護(hù)人類和動(dòng)物健康,抗擊感染性疾病、癌癥或過(guò)敏癥極具前景的手段。DNA疫苗優(yōu)點(diǎn)在于其安全性高(使用的質(zhì)粒在真核細(xì)胞中是非復(fù)制性的),生產(chǎn)系統(tǒng)簡(jiǎn)單(大腸桿菌的擴(kuò)增和純化不復(fù)雜且相對(duì)廉價(jià)),能刺激強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫反應(yīng)(由轉(zhuǎn)染細(xì)胞引起的MHC I介導(dǎo)的抗原遞呈),具有組合疫苗的可能性(僅需混合不同的DNA分子[8]),無(wú)需冷凍運(yùn)輸裝置(DNA的高度穩(wěn)定性)。

        早期的臨床試驗(yàn)[9]顯示,以單純皰疹病毒gD糖蛋白為亞基的疫苗是安全的,且在人體中能誘導(dǎo)病毒中和抗體。Stanberr等[10]觀察到適度的疫苗效力能對(duì)血清反應(yīng)陰性的個(gè)體起到保護(hù)作用。gD是單純皰疹病毒的一個(gè)基本糖蛋白,在病毒的侵入過(guò)程中有兩個(gè)主要作用:綁定兩個(gè)主要的細(xì)胞受體(HVEM或nectin-1);激活病毒融合裝置的下游組分,gH/gL和gB[11]。在gD上至少有5個(gè)特異性的抗原表位能誘導(dǎo)病毒中和抗體。本研究以gD糖蛋白基因?yàn)榛A(chǔ),構(gòu)建含有g(shù)D全長(zhǎng)序列的真核重組表達(dá)質(zhì)粒,并觀察其在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況。

        質(zhì)粒載體pcDNA3具有高度的穩(wěn)定性并能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá),而其抗性選擇基因氨芐青霉素基因可能對(duì)人體存在潛在的威脅。本研究對(duì)含Amp抗性基因的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3進(jìn)行重組,以Kan抗性基因替換Amp抗性基因,構(gòu)建了含Kan抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3Kan-gD,為該DNA疫苗更適應(yīng)于人體奠定了基礎(chǔ)。

        綜上所述,含有單純皰疹病毒gD糖蛋白全長(zhǎng)序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD能在Hela細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)gD蛋白,有可能成為抗單純皰疹病毒DNA疫苗候選物之一。

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