何卓晶，陶 薇，傅 婷，周寒鵬，洪 艷

(杭州醫(yī)學(xué)院 生物工程研究所，浙江 杭州 310013)

2型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 2， HSV-2)感染可引起皮膚水泡、潰瘍性病變及神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的并發(fā)癥，易傳播給易感的性伴侶、胎兒和新生兒[1]，可增加感染人類免疫缺陷病毒的危險(xiǎn)[2-3]。HSV-2感染導(dǎo)致的生殖器皰疹是引起生殖器區(qū)域潰瘍的原因之一，可引起相關(guān)的公共健康問題[4-5]。HSV-2初次感染期間，病毒即在骶神經(jīng)節(jié)中終身潛伏下來，并能再次激活導(dǎo)致復(fù)發(fā)。目前，生殖器皰疹的標(biāo)準(zhǔn)治療和預(yù)防藥物為鳥苷類似物，如阿昔洛韋，伐昔洛韋，噴昔洛韋和泛昔洛韋。鳥苷類似物藥物能通過干擾HSV的DNA聚合酶而抑制病毒復(fù)制，但該類藥物需每日給藥以維持其抑制病毒復(fù)制的作用，且很多HSV毒株對(duì)該類抗病毒藥物產(chǎn)生了抗性[6]。疫苗是控制生殖器皰疹的另一有效策略，HSV-2病毒衣殼上的糖蛋白D(glycoprotein D， gD)具有較高的免疫原性，近年來逐漸成為單純皰疹病毒亞單位疫苗的研究熱點(diǎn)。本研究構(gòu)建gD糖蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD，并觀察其在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況，旨在為單純皰疹病毒亞單位疫苗的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 質(zhì)粒pcDNA3Kan為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含卡那霉素抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，pcDNA3Kan-gD為本實(shí)驗(yàn)室保存的含有HSV-2糖蛋白gD基因的質(zhì)粒。Hela細(xì)胞、BALB/c小鼠抗HSV-2血清均為本單位生物工程所制備及保存。RNA抽提試劑盒購自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、高保真DNA聚合酶均購自Promage公司，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SuperFectinTMⅡ in Vrio DNA transfection Reagent試劑盒購自上海普飛生物技術(shù)有限公司，高純度質(zhì)粒小提試劑盒、Goat Anti-Mouse IgG DylightTM448及Hochest 33258購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 真核重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3Kan-gD的構(gòu)建根據(jù)HSV-2gD基因的編碼序列以及質(zhì)粒載體pcDNA3kan的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，在上下游引物的兩端分別添加EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，上游引物P1：5’ATCGAATTCAACCACTAGTCGCCG 3’；下游引物P2：5’CGCTCGAGACTCCCTTTATGC 3’。從pcDNA3Kan-gD上通過PCR擴(kuò)增獲取gD全長(zhǎng)序列基因片斷，大小為420 bp。然后用EcoRI和XhoI分別對(duì)真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3Kan及PCR擴(kuò)增得到的gD基因片斷進(jìn)行雙酶切。將酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、克隆，獲得真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD。

1.3 質(zhì)粒的提取與純化 將含真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD的E.coliBL21菌株和含pcDNA3Kan的E.coliBL21菌株分別于含卡那霉素(25 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒抽提并純化pcDNA3Kan質(zhì)粒和真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和A260/A280。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞按照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒的使用說明進(jìn)行：于轉(zhuǎn)染前一天將Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合度且生長(zhǎng)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前更換新鮮的完全培養(yǎng)基并孵育30～60 min。于1.5 mL無菌離心管中準(zhǔn)備以下溶液，溶液A：用不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基分別將0.188 μg、0.375 μg和0.750 μg(即1×、2×和4×)真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD稀釋至38 μL；溶液B：用不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基將2.25 μL SuperFectinTMⅡ試劑稀釋至38 μL；將溶液B加入到溶液A中并混勻，室溫孵育15 min。將SuperFectinTMⅡ/DNA混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板以混勻。5%CO2，37℃培養(yǎng)12 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用半定量RT-PCR技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)梯度轉(zhuǎn)染的pcDNA3Kan-gD重組質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.6 半定量RT-PCR 傾去轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞的培養(yǎng)上清，用0.25%的胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞。按RNA抽提試劑盒使用說明提取細(xì)胞總RNA，提取的RNA溶于DEPC處理水中。按cDNA第一鏈合成試劑盒使用說明完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并合成cDNA第一鏈后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。上游引物：5’GCGTGTTTACCACATTCAGCC 3’；下游引物：5’TCCGTCCAGTCGTTTATCTTCA 3’。β-actin的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。上游引物：5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3’；下游引物：5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3’。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并采用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

1.7 免疫熒光技術(shù) 消化梯度轉(zhuǎn)染(1×和4×)pcDNA3Kan-gD重組質(zhì)粒的Hela細(xì)胞進(jìn)入12孔板，待細(xì)胞貼壁，用PBS清洗3次，4%多聚甲醇固定30 min，PBS清洗；于37 ℃用含0.3% Triton的PBS處理30 min，PBS清洗3次；用含1%BSA的PBS封閉30 min后，PBS清洗1次；以BALB/c小鼠抗HSV-2血清(1∶100稀釋)作為一抗，4 ℃孵育過夜，次日PBS清洗；以Goat Anti-Mouse IgG DylightTM488作為熒光二抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗；加入Hochest 33258染液染細(xì)胞核10 min，PBS清洗。采用熒光倒置顯微鏡(CKX41，日本OLYMPUS)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD的鑒定 將構(gòu)建完成的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD以限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在420 bp處顯示一條帶，大小與預(yù)期相符，見圖1。

M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA；1：真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD；2：真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3Kan；3：通過PCR擴(kuò)增獲取的gD全長(zhǎng)序列基因片斷；4：pcDNA3Kan-gD的EcoR I和Xho I雙酶切片段。圖1 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD的鑒定結(jié)果

2.2 質(zhì)粒提純 將純化的質(zhì)粒用無菌蒸餾水定容至0.5 mL后，測(cè)定其濃度和純度。純化后的pcDNA3Kan-gD的濃度為0.16 μg/μL， A260/A280為1.703；純化后的pcDNA3Kan的濃度為0.14 μg/μL，A260/A280為1.718。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后半定量RT-PCR結(jié)果 轉(zhuǎn)染pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞總RNA經(jīng)RT-PCR后擴(kuò)增出大小為420 bp的gD基因條帶，β-actin基因條帶大小為318 bp；分析條帶灰度值顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的相對(duì)表達(dá)量(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與β-actin表達(dá)量的比值)與轉(zhuǎn)染倍數(shù)呈劑量依賴關(guān)系；見圖2。

M：標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA；1：gD基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.188 μg，1×)；2：gD基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.375 μg，2×)；3：gD基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.750 μg，4×)；4：β-actin基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.188 μg，1×)；5：β-actin基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.375 μg，2×)；6：β-actin基因片段(轉(zhuǎn)染量為0.750 μg，4×)；**P<0.01; *** P<0.001。圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后半定量RT-PCR結(jié)果

2.4 免疫熒光技術(shù)分析結(jié)果 轉(zhuǎn)染pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，1×與4×轉(zhuǎn)染倍數(shù)的Hela細(xì)胞平均光密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖3。

A：轉(zhuǎn)染1× pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞；B: 轉(zhuǎn)染4× pcDNA3Kan-gD的Hela細(xì)胞；***P<0.001。圖3 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Hela細(xì)胞免疫熒光分析結(jié)果

3 討論

DNA疫苗通常由DNA質(zhì)粒構(gòu)建而成。當(dāng)DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入疫苗接種者后表達(dá)蛋白抗原，由此介導(dǎo)外源蛋白的內(nèi)源性生產(chǎn)，包括其天然構(gòu)造和轉(zhuǎn)錄后適當(dāng)?shù)男揎?。早期研究[7]結(jié)果認(rèn)為，向哺乳動(dòng)物肌肉中直接注射攜帶真核基因的質(zhì)粒DNA，能誘導(dǎo)編碼蛋白的內(nèi)源性表達(dá)及抗編碼蛋白的特異性免疫反應(yīng)，由此奠定了DNA疫苗的發(fā)展基礎(chǔ)。這種以DNA為基礎(chǔ)的免疫實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)展為保護(hù)人類和動(dòng)物健康，抗擊感染性疾病、癌癥或過敏癥極具前景的手段。DNA疫苗優(yōu)點(diǎn)在于其安全性高(使用的質(zhì)粒在真核細(xì)胞中是非復(fù)制性的)，生產(chǎn)系統(tǒng)簡(jiǎn)單(大腸桿菌的擴(kuò)增和純化不復(fù)雜且相對(duì)廉價(jià))，能刺激強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫反應(yīng)(由轉(zhuǎn)染細(xì)胞引起的MHC I介導(dǎo)的抗原遞呈)，具有組合疫苗的可能性(僅需混合不同的DNA分子[8])，無需冷凍運(yùn)輸裝置(DNA的高度穩(wěn)定性)。

早期的臨床試驗(yàn)[9]顯示，以單純皰疹病毒gD糖蛋白為亞基的疫苗是安全的，且在人體中能誘導(dǎo)病毒中和抗體。Stanberr等[10]觀察到適度的疫苗效力能對(duì)血清反應(yīng)陰性的個(gè)體起到保護(hù)作用。gD是單純皰疹病毒的一個(gè)基本糖蛋白，在病毒的侵入過程中有兩個(gè)主要作用：綁定兩個(gè)主要的細(xì)胞受體(HVEM或nectin-1)；激活病毒融合裝置的下游組分，gH/gL和gB[11]。在gD上至少有5個(gè)特異性的抗原表位能誘導(dǎo)病毒中和抗體。本研究以gD糖蛋白基因?yàn)榛A(chǔ)，構(gòu)建含有g(shù)D全長(zhǎng)序列的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，并觀察其在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況。

質(zhì)粒載體pcDNA3具有高度的穩(wěn)定性并能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，而其抗性選擇基因氨芐青霉素基因可能對(duì)人體存在潛在的威脅。本研究對(duì)含Amp抗性基因的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3進(jìn)行重組，以Kan抗性基因替換Amp抗性基因，構(gòu)建了含Kan抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3Kan-gD，為該DNA疫苗更適應(yīng)于人體奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，含有單純皰疹病毒gD糖蛋白全長(zhǎng)序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3Kan-gD能在Hela細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)gD蛋白，有可能成為抗單純皰疹病毒DNA疫苗候選物之一。