韋任雄 陳丹丹 朱玲 張玉柱 陳前軍

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510006）；2廣東省中醫(yī)院乳腺外科（廣州510120）

乳腺癌是女性最常見和高發(fā)的惡性腫瘤，根據(jù)最新全球的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)［1］，其發(fā)病率和病死率在女性癌癥中的占比分別為24.2%和15.0%，是女性癌癥死亡的首要原因。在我國，乳腺癌也是女性癌癥死亡的主要原因，并且隨著人們生活方式的西化，伴隨人口增長和人口老齡化，我國未來癌癥負(fù)擔(dān)尤其乳腺癌的負(fù)擔(dān)會迅速增加［2］。因此，了解雌激素的致癌作用及機制，對乳腺癌的預(yù)防及藥物開發(fā)具有重要意義。

臨床流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，接受激素替代療法［3］、早初潮、晚絕經(jīng)、肥胖［4］等都將增加女性患乳腺癌的風(fēng)險。雌激素通過受體介導(dǎo)的過程［5］或其毒性代謝物刺激細(xì)胞生長和增殖，導(dǎo)致乳腺的癌變［6］。體內(nèi)外實驗均證實雌激素對乳腺的致癌性，而抗雌激素能預(yù)防乳腺癌的發(fā)生［7-8］。核因子E2 相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）作為重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，其通過誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白表達(dá)（如NQO1、HO-1、GCLM 和GCLC），有利于改善機體氧化應(yīng)激狀態(tài)和保護細(xì)胞功能［9］。因此，Nrf2轉(zhuǎn)錄因子失活，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至癌變［10-11］。本研究的目的是通過雌二醇（Estradiol，E2）誘導(dǎo)正常乳腺細(xì)胞生物學(xué)改變來評估其致癌作用，并探討其相關(guān)的通路機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人源正常乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A 和MCF-12A 由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺癌研究團隊惠贈。雌激素（E2758）購自Sigma公司；乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）測定試劑盒購自南京建成公司；8-羥基脫氧鳥苷（8-Hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）檢測試劑盒購自CUSABIO 公司；AnnexinVFITC 凋亡檢測試劑盒購自Thermo 公司；Nrf2、HO-1 抗體購自Abcam 公司，其二抗購自聯(lián)科生物。

1.2 儀器CKX41 倒置熒光顯微鏡（Olympus）；VICTOR X5 型 酶標(biāo)儀（Biotek 公司）；KQ-100DE 型數(shù)控浴式超聲儀（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；1-15K冷凍臺式離心機（德國Sigma公司）；流式細(xì)胞儀FACS VantageTM（美國Becton Dickinson公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT 實驗將細(xì)胞以每孔5 × 103個的密度，接種于96 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，加入含不同濃度雌激素（0、0.5、1、5、10、100 nmol/L）培養(yǎng)基，每組設(shè)5 個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液和100 μL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去MTT 溶液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上避光震蕩10 min。多功能酶標(biāo)儀上測定吸光度（OD）值（測定波長為490 nm）。

1.3.2 熒光探針DCFH-DA 檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）將細(xì)胞以5 ×105個/孔接種到6 孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，按分組進(jìn)行給藥處理。藥物作用24 h 后，每孔加入1 mL 10 μmol/L 的DCFH-DA 稀釋液，避光孵育20 min，每隔3～5 min 搖勻一次，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次。在酶標(biāo)儀488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長檢測各組的熒光強弱。

1.3.3 檢測8-OHdG、LDH、ROS、SOD、GPX、CAT

和TAC 水平雌激素誘導(dǎo)細(xì)胞后，采用ELISA 法檢測細(xì)胞內(nèi)8-OHdG 水平、微量酶標(biāo)法檢測LDH 水平、可見光法測定CAT 活性、羥胺法測定SOD 活性、比色法測定GPX 活性、微板法測定TAC 活性，按說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 AnnexinV/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞以5 × 105個/孔接種到6 孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按分組進(jìn)行給藥處理。藥物作用72 h 后，用無EDTA 胰酶消化并收集細(xì)胞懸液，PBS 清洗2 次。加入400 μL 的Binding buffer 重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide混勻后室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 劃痕實驗將細(xì)胞以5 × 105接種在6 孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)100%時，用200 μL 的tip 槍頭在細(xì)胞中央劃痕，PBS 清洗3 次，按分組進(jìn)行給藥處理。于0 h 和48 h 分別在相同位置拍照，并計算劃痕愈合率，劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%）

1.3.6 平板克隆實驗將細(xì)胞以1 000 個/孔接種到6 孔板中，24 h 后，按分組進(jìn)行給藥處理。孵育2 周后取出培養(yǎng)板，期間每3 天更換一次培養(yǎng)液。用PBS 清洗3 次。4%多聚甲醛固定20 min。吸去固定液，加適量0.02%結(jié)晶紫染色液染色30 min。光學(xué)顯微鏡下觀察實驗組與對照組形成的細(xì)胞集落。

1.3.7 Western blotting將細(xì)胞以5×105個接種在6 孔板上，待細(xì)胞貼壁，加入含雌激素（0、5 nmol/L）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度后，取35 μg 蛋白質(zhì)量進(jìn)行上樣電泳，然后轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF 膜，接著封閉1 h、一抗4 ℃孵育過夜、第2 天孵二抗1 h，最后曝光顯影。

1.3.8 RT-PCR將細(xì)胞以5×105個接種在6 孔板上，待細(xì)胞貼壁，加入含雌激素（0、5 nmol/L）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。采用實時熒光定量PCR（qRTPCR）法測定。Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，全自動熒光定量PCR 儀擴增并進(jìn)行熒光定量檢測。設(shè)計合成引物，Nrf2引物序列：上游5′-GACGGTATGCAACAGGACATTGAG-3′，下游5′-AACTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGGA-3′擴增片段長度為120 bp。HO-1 引物序列：上游5′-ACATCGACAGCCCCACCAAGTTCAA-3′，下游5′-CTGACGAAGTGACGCCATCTGTGAG-3′，擴增片段長度為110 bp。NQO-1 引物序列：上游5′-GGATTGGACCGAGCTGGAA-3′，下游5′-AATTGCAGTGAAGATGAAGGCAAC-3′，擴增片段長度為120 bp。GAPDH 引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增片段長度為110 bp。PCR 反應(yīng)條件：10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，40 個循環(huán)，GAPDH 為內(nèi)參，檢測各模板的Ct 值（C 代表cycle，T 代threshold）。實驗重復(fù)3 次。

1.3.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19 系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗確定兩組間差異的統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌激素對MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞增殖、DNA 氧化損傷及細(xì)胞凋亡的影響使用不同濃度的雌激素處理MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，0 ～10 nmol/L 的雌激素濃度可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并且5 nmol/L 為最佳促進(jìn)濃度（圖1A）。與空白組相比較，雌激素組中細(xì)胞的活性顯著增高（圖1B），同時8-OHdG 和LDH 水平明顯上升（圖1C、1F），即細(xì)胞毒性和DNA 氧化損傷增高，但細(xì)胞凋亡水平反而降低（圖1D、1E），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 雌激素對MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞增殖、DNA 氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 The effects of E2 on cell proliferation，DNA oxidative damage and cell apoptosis of MCF-10A and MCF-12A cells

2.2 雌激素對MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞遷移和克隆能力的影響通過劃痕試驗和克隆形成實驗，來評估雌激素對正常乳腺細(xì)胞的致癌性。與空白組相比較，雌激素組中乳腺細(xì)胞克隆能力（圖2A、2B）和遷移顯著增強（圖2C-E），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

2.3 雌激素對MCF-10A和MCF-12A細(xì)胞ROS及氧化酶的影響與空白組相比較，雌激素作用后，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 的積累，使ROS 的水平顯著上升（圖3A），同時雌激素組細(xì)胞內(nèi)SOD、GPX、CAT和TAC 等氧化酶活性明顯受到抑制（圖3B-E），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

2.4 雌激素對MCF-10A和MCF-12A細(xì)胞Nrf2及其下游蛋白的影響雌激素組Nrf2 和HO-1 蛋白低表達(dá)于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖4A-C）；與空白組相比較，雌激素組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1 和NQO1mRNA 表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖4D-F）

3 討論

圖2 雌激素對MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞克隆和遷移能力的影響Fig.2 The effects of E2 on cell clone and migration of MCF-10A and MCF-12A cells

乳腺癌主要由乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有異質(zhì)性，并且乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升發(fā)展趨勢［12］。在此基礎(chǔ)上，了解乳腺癌的發(fā)病機制，尋找乳腺癌發(fā)生發(fā)展的遺傳標(biāo)志，對乳腺癌預(yù)防性治療，降低發(fā)病率具有重要意義。研究［13］發(fā)現(xiàn)Nrf2 信號通路的活化可以促進(jìn)其下游抗氧化酶NQO1、HO-1 等的表達(dá)，氧化酶通過消除活性氧等有害物質(zhì)，防止DNA 的氧化損傷，預(yù)防細(xì)胞癌變。

圖3 雌激素對MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞ROS 和氧化酶的影響Fig.3 The effects of E2 on ROS and indicators related to Oxidase of MCF-10A and MCF-12A cells

圖4 雌激素對MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞Nrf2 及其下游蛋白、mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 The effects of E2 on Nrf2 and downstream protein and mRNA expression in MCF-10A and MCF-12A cells

研究［14］證實雌激素的氧化代謝途徑導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。首先8-OHdG 作為DNA 氧化損傷的經(jīng)典標(biāo)志物，而DNA 損傷可導(dǎo)致基因突變是癌癥發(fā)生過程中的關(guān)鍵步驟［15］。另外氧化應(yīng)激是DNA 損傷的重要原因之一［16］。而氧化酶能抑制氧化應(yīng)激清除產(chǎn)生的ROS，保護細(xì)胞免受損傷［17］。Nrf2 作為細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，調(diào)控HO-1和NQO1 等氧化酶的表達(dá)［18-19］，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，消除致癌物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，雌激素可以刺激MCF-10A 和MCF-12A 細(xì)胞增殖，并且在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度增加，增殖效果越明顯。同時雌激素能增強正常乳腺細(xì)胞遷移和克隆能力，降低細(xì)胞凋亡水平，與YAN 等［20］的研究結(jié)果相一致。ANWESHA 等［21］通過雌激素誘導(dǎo)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)8-OHdG 的表達(dá)水平明顯增高，確定雌激素可誘導(dǎo)DNA 的氧化損傷，本實驗研究也有相一致的結(jié)果。研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，雌激素能夠促進(jìn)ROS在胞內(nèi)積累和抑制SOD、GPX、CAT 和TAC 等氧化酶的活性，并調(diào)控Nrf2 及其下游HO-1 和NQO1 的表達(dá)，引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 的氧化損傷，使細(xì)胞發(fā)生生物學(xué)上的改變，最終向癌變轉(zhuǎn)化，與SINGH 等［22-23］的研究結(jié)果也有相一致。

綜上所述，本研究從氧化應(yīng)激的角度，并引入近期熱點研究的抗氧化基因Nrf2，發(fā)現(xiàn)雌激素可以調(diào)節(jié)Nrf2/ROS 通路，誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)的改變，揭示氧化應(yīng)激參與乳腺癌的發(fā)病機制。本實驗存在一定的局限性，細(xì)胞僅在雌激素作用下研究，雌激素代謝物以及其拮抗劑進(jìn)行平行實驗以保證實驗可靠性；同時單純體外研究具有片面性，后續(xù)將在動物實驗?zāi)Ｐ蜕线M(jìn)一步研究，以期為乳腺癌的預(yù)防治療提供潛在靶標(biāo)。