楊亮 石科 李敏霞 郭丹

河南醫(yī)學高等?？茖W校微生物與免疫學教研室（鄭州451191）

食管鱗癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率都很高［1］，預后差且易復發(fā)，75%的患者確診后1年內(nèi)死亡，5年生存率僅為5%～10%［2］。

最近研究表明蛋白酶體抑制劑是臨床上有效的抗癌治療方法，蛋白酶體抑制劑通過抑制26S蛋白酶體的活性，阻斷參與細胞凋亡調(diào)控及信號傳導的蛋白質(zhì)的降解，誘導細胞凋亡，在靶向癌癥治療中變得越來越重要［3-5］。依沙佐米（Ixazomib）是一種可口服的蛋白酶體的可逆性抑制劑，通過結合并抑制20S 蛋白酶體的β5 亞基而發(fā)揮作用，目前用于治療多發(fā)性骨髓瘤［6-8］，研究表明依沙佐米也可以抑制多種實體瘤的生長［9-12］，然而依沙佐米對食管鱗癌細胞的影響未見報道。

食管鱗癌細胞中存在異常激活的mTOR 信號通路，并且分化程度越低mTOR 信號通路的激活水平越高［13-14］。此外，在食管癌組織標本中mTOR信號通路也處于激活狀態(tài)，mTOR 和p-mTOR 以及下游分子的表達升高，而磷酸酶和tensin 蛋白的表達降低［15］。依沙佐米對食管鱗癌細胞的作用是否與mTOR/p70S6K 信號通路有關仍不清楚，因此本研究將探討蛋白酶體抑制劑依沙佐米是否通過調(diào)控mTOR/p70S6K 信號通路參與食管鱗癌細胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人食管鱗癌細胞系KYSE-140和KYSE-150 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.1.2 試劑依沙佐米（Selleck，美國），CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（Beyotime，中國），Cell-Light EdU細胞增殖檢測試劑盒（RoboBio，中國），Annexin VAPC/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒（KeyGEN Biotech，中國），細胞總蛋白提取試劑盒（Solarbio，中國），增強型化學發(fā)光試劑盒（Thermo，美國），Caspase-3 熒光測定試劑盒（BioVision，美國），SYBR?Green RT-qPCR（Sigma，美國），mTOR 抗體、p70S6K抗體、p-mTOR 抗體、p-p70S6K 抗體、4E-BP1 抗體和GAPDH 抗體（Sant Cruze，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞活力的檢測分別采用CCK-8 法和Edu 法檢測蛋白酶體抑制劑依沙佐米對食管鱗癌細胞KYSE-140 和KYSE-150 增殖的影響。將細胞接種在6 孔板中過夜培養(yǎng)，用不同濃度的依沙佐米（0、10、20、30、40 nmol/L）處理細胞24 h，CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力。同時用Cell-Light EdU細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞增殖，即向細胞培養(yǎng)基中加入EdU（50 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，加入100 μL Apollo 染色液，避光室溫孵育30 min，用含0.5%Triton X-100的PBS 清洗，加入Hoechst 33342 避光孵育30 min使DNA 染色。

1.2.2 細胞凋亡檢測將細胞接種于6 孔板過夜培養(yǎng)，用不含EDTA 的胰酶消化細胞，并用含2%BSA 的PBS 清洗三遍，Annexin V-APC/7-AAD 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡，F(xiàn)ACSCalibur 流式細胞儀分析細胞凋亡，Annexin V-APC 陽性細胞判定為凋亡細胞。用Cell Quest 3.0 軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，計算凋亡細胞的百分比。

1.2.3 Caspase-3 激酶活性檢測用caspase-3 熒光測定試劑盒檢測細胞caspas-3 活性，將細胞和DEVD-AFC 底物于37 ℃孵育1 h 對細胞進行染色，DEVD 多肽斷裂后產(chǎn)生熒光，用FACSCalibur 流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 RT-qPCR檢測基因mRNA表達水平用Trizol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用SYBR?Green RTqPCR 試劑盒檢測mTOR、p70S6K 及4E-BP1 基因的表達，引物如表1 所示，反應體系：SYBR Master Mix溶液15 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水7 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃5 min，共30 個循環(huán)；4 ℃終止反應。

表1 RT-qPCR 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences of RT-qPCR

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平用細胞總蛋白提取試劑盒提取食管鱗癌細胞總蛋白，SDSPAGE 分離樣品蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，與一抗4 ℃過夜孵育，再與HRP 標記的二抗室溫孵育2 h，然后用增強型化學發(fā)光試劑盒進行顯色。Image J軟件對各條帶進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學方法所有實驗至少重復三次，計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組之間的差異進行t檢驗分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 依沙佐米對食管鱗癌細胞增殖能力的影響分別用不同濃度（0、10、20、30、40 nmol/L）的依沙佐米處理食管鱗癌細胞（KYSE-140 和KYSE-150）24 h，CCK-8 法檢測細胞增殖能力。結果顯示低濃度的依沙佐米（10 nmol/L）即可抑制KYSE-140 和KYSE-150 細胞的增殖，與對照組（0 nmol/L）相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細胞的增殖能力隨著依沙佐米濃度的增加而下降，說明依沙佐米對食管鱗癌細胞增殖的抑制存在劑量依賴性。當依沙佐米的濃度達40 nmol/L 時，KYSE-140 和KYSE-150 細胞活力僅有31.3%和20.3%（圖1A）。用20 nmol/L 的依沙佐米處理細胞12 h 即可顯著抑制細胞的增殖（P＜0.05），且抑制程度隨著時間的延長而升高（圖1B）。Edu 結果顯示依沙佐米可以抑制食管鱗癌細胞的增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2），與CCK-8 結果一致。

圖1 CCK-8 檢測細胞增殖結果Fig.1 Results of cell proliferation by CCK-8

圖2 Edu 檢測細胞增殖結果Fig.2 Cell proliferation results by Edu assay

2.2 依沙佐米對食管鱗癌細胞凋亡的影響用流式細胞儀檢測依沙佐米（20 nmol/L）對食管鱗癌細胞凋亡的影響結果見圖3A 和3B，依沙佐米處理KYSE-140 和KYSE-150 細胞24 h 后，細胞凋亡率分別為30.67%和34.33%，與對照組相比細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，圖3C）。此外，依沙佐米可以增強食管鱗癌細胞的caspase-3 活性（P＜0.05，圖3D）。Western blot結果顯示與對照組相比，依沙佐米處理組的cleaved caspase-3 的表達顯著增高（P＜0.05），其中KYSE-140 細胞增加了2.16 倍，KYSE-150 細胞增加了3.07 倍（圖3E、F），并且處理組出現(xiàn)了PARP的裂解產(chǎn)物cleaved PARP，而對照組未見PARP 的裂解（圖3E）。磷酸化的p38 被鑒定為凋亡激活標志物［7］，依沙佐米處理后p-p38 的表達顯著升高（P＜0.05），其中在KYSE-140細胞中升高了1.74倍，在KYSE-150 細胞中升高了2.17 倍（圖3G），說明依沙佐米可以誘導食管鱗癌細胞的凋亡。

2.3 依沙佐米對mTOR/p70S6K信號通路的影響與對照組相比依沙佐米處理后KYSE-140 和KYSE-150 細胞mTOR 基因的mRNA 表達水平均顯著下降（P＜0.05），且mTOR 兩個下游靶基因p70S6K 和4E-BP1 的mRNA 表達也受到了抑制（P＜0.05）。見表2。Western blot 結果顯示，依沙佐米處理后KYSE-140和KYSE-150細胞中mTOR蛋白的表達顯著下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4A、B），p70S6K 和4E-BP1 蛋白的表達沒有明顯變化（P＞0.05），而p-p70S6KThr421/Ser424 和p-4EBP1Thr36蛋白的表達顯著下降（P＜0.05，圖4C-F），說明依沙佐米可以抑制食管鱗癌細胞的mTOR/p70S6K 信號通路。

3 討論

圖3 依沙佐米對食管鱗癌細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Ixazomib on the apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma cells

圖4 mTOR 信號通路相關蛋白的Western blot 結果Fig.4 Western blot results of mTOR signaling pathway protein

表2 mTOR、p70S6K 和4E-BP1 的RT-qPCR 結果Tab.2 RT-qPCR results of mTOR，p70S6K and 4E-BP1 genes ±s

表2 mTOR、p70S6K 和4E-BP1 的RT-qPCR 結果Tab.2 RT-qPCR results of mTOR，p70S6K and 4E-BP1 genes ±s

注：與對照組相比*P ＜0.05

基因mTOR p70S6K 4E-BP1 KYSE-140對照組1.67±0.29 1.37±0.14 0.79±0.09+Ixazomib 0.79±0.13*0.68±0.10*0.40±0.07*KYSE-150對照組2.88±0.21 1.54±0.13 0.66±0.08+Ixazomib 0.56±0.17*0.45±0.06*0.29±0.05*

依沙佐米是第二代蛋白酶體抑制劑，相對于硼替佐米（PS-341）改善了藥代動力學和藥效學特征。多項研究表明依沙佐米不僅可用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療［16-17］，而且對多種類型的實體瘤的生長具有抑制作用［18-21］。有報道顯示依沙佐米對人結腸腺癌Caco2 細胞具有抗增殖作用，可以下調(diào)NF-κB 和c-myc 的mRNA 表達，通過使線粒體的去極化和激活caspase-3 的活性誘導細胞凋亡［22］。體外結果表明依沙佐米對乳腺癌細胞具有抗腫瘤作用，可以誘導細胞的自噬和MKP-1 表達，促進JNK 和p38 的磷酸化，抑制IκBα的降解，增強細胞對阿霉素的敏感性［23］。體內(nèi)研究也顯示依沙佐米可以抑制腫瘤的生長，研究顯示在成神經(jīng)細胞瘤的小鼠移植瘤模型中，依沙佐米具有抗腫瘤的功效［24］。

本研究結果表明依沙佐米可以抑制食管鱗癌細胞KYSE-140 和KYSE-150 的增殖，并且存在劑量依賴性，低劑量的依沙佐米（10 nmol/L）即可對食管鱗癌細胞的生長產(chǎn)生抑制作用。依沙佐米通過增強caspase-3 活性，誘導PARP 發(fā)生裂解生成cleaved PARP，并促進凋亡激活標志物p-p38的表達來誘導食管鱗癌細胞的凋亡，說明依沙佐米可以抑制食管鱗癌細胞的增殖并誘導細胞的凋亡。

研究表明食管鱗癌細胞中mTOR/p70S6K 信號通路處于異常激活狀態(tài)，mTOR 的高表達促使兩個下游靶蛋白p70S6K 和4E-BP1 發(fā)生磷酸化，從而激活mTOR/p70S6K 信號通路［25-27］。對食管鱗癌臨床組織標本的研究也表明mTOR 信號通路處于激活狀態(tài)，其中磷酸肌醇-3 激酶、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4E-BP1 等蛋白在腫瘤組織中顯著上調(diào)，相反地磷酸酶和tensin 蛋白同源物的表達顯著下調(diào)，特別是在pT3-T4 腫瘤中下調(diào)更為顯著［15］。此外食管鱗癌組織中mTOR 信號通路蛋白的高表達和磷酸酶和tensin 蛋白同源物的低表達，與有無淋巴結轉(zhuǎn)移和晚期TNM 分期存在相關性。mTOR靶蛋白和p70S6K1 的高表達與總體生存率相關，mTOR 信號通路的過表達被證明是食管鱗癌不良預后的獨立危險因素［15］。本研究結果顯示mTOR基因的mRNA 和蛋白表達水平均受到抑制，兩個下游靶基因p70S6K 和4E-BP1 的mRNA 表達也受到了抑制。依沙佐米處理前和處理后p70S6K和4E-BP1蛋白的表達沒有明顯變化，但p-p70S6KThr421/Ser424 和p-4E-BP1Thr36 蛋白的表達顯著下降，說明依沙佐米可能通過下調(diào)mTOR 的表達使下游靶點p70S6K 和4E-BP1 的磷酸化受到抑制，從而抑制食管鱗癌細胞中的mTOR/p70S6K 信號通路。

綜上所述，依沙佐米可以抑制食管鱗癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，可能通過抑制mTOR/p70S6K 信號通路參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)，為開發(fā)蛋白酶體抑制劑作為食管鱗癌治療藥物提供依據(jù)。