林江波 王偉英 鄒暉 戴藝民

摘要：[目的]克隆鐵皮石斛（Dendrobium officinale）甾醇類化合物合成關(guān)鍵酶鯊烯單加氧酶（SqualeneMonooxygenase，SQE）基因，并對其進行生物信息學分析和不同營養(yǎng)生長期莖和葉中的表達模式分析。[方法]根據(jù)鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組測序獲得帶5末端的SQE基因片段，設(shè)計DoSQEI與DoSQE2基因的3RACE引物，克隆全長eDNA，利用生物信息學分析軟件對DoSQEl與DoSQE2基因及其編碼蛋白序列進行分析。運用實時熒光定量PCR檢測DoSQEl與DoSQE2基因在鐵皮石斛營養(yǎng)生長期的8月、10月、12月莖和葉中的表達模式。[結(jié)果]DoSQEl基因cDNA序列全長1796bp（GenBank登錄號MTl60182），含有1個1554bp的ORF，編碼517個氨基酸;DoSQE2基因cDNA序列全長1963bp（GenBank登錄號MTl60183），含有1個1578bp的ORF，編碼525個氨基酸。DoSQEl具有2個跨膜區(qū)，分別在4～22aa和55～72aa;DoSQE2只有在5～13aa的1個跨膜區(qū)。DoSQEl蛋白在204～476aa、DoSQE2蛋白在211～484aa處含有鯊烯環(huán)氧酶結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析表明，DoSQEl與姬蝴蝶蘭SQE（XP020599860.1）的親緣關(guān)系最近，DoSQE2與姬蝴蝶蘭SQE（XP 020579136.1）的親緣關(guān)系最近。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，莖和葉中都能檢測到2個基因的表達，葉的表達量顯著高于莖。DoSQEl基因在8月份表達量最高，DoSQE2基因在10月份表達量最高。[結(jié)論]本研究克隆得到DoSQEl和DoSQE2基因，發(fā)現(xiàn)DoSQEl和DoSQE2基因的表達模式存在差異，該結(jié)果為進一步研究鐵皮石斛甾醇類化合物生物合成機理及代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;鯊烯單加氧酶;生物信息學分析;熒光定量PCR

中圖分類號：s567.239文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）05-0495-08

0 引言

（研究意義）植物甾醇是一類生物活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、預防和治療心腦血管疾病等作用。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是名貴中藥材，具有增強免疫力、降血糖和抗腫瘤等生理活性。已有研究表明鐵皮石斛含有豆甾醇、β谷甾醇、γ-谷甾醇和油菜甾醇等植物甾醇類次生代謝產(chǎn)物。鯊烯單加氧酶（SqualeneMonooxygenase，SQE）又稱鯊烯環(huán)氧酶（Squalene epoxidase，SE），催化角鯊烯生成2，3-氧化鯊烯。環(huán)阿屯醇合酶（Cycloartenolsynthase，CAS）催化2，3-氧化鯊烯形成環(huán)阿屯醇，代謝流向植物甾醇;羽扇豆醇合成酶（Lupeolsynthase，LS）、β-香樹脂醇合成酶（β-amyrin synthase，β-AS）和達瑪烯二醇合成酶（Dammarenediol synthase，DS）催化2，3-氧化鯊烯形成羽扇豆醇、β-香樹脂醇和達瑪烯二醇，代謝轉(zhuǎn)向三萜類生物合成通道。因此，SQE是植物甾醇和三萜類物質(zhì)合成途徑的一個關(guān)鍵限速酶。開展鐵皮石斛SQE基因的克隆及表達模式分析，對探討鐵皮石斛植物甾醇生物合成分子機制及代謝調(diào)控具有重要的意義。（前人研究進展）孫蓉等克隆了金龍膽草（Conyza blinii h.Lev）CbSQE基因，編碼525個氨基酸，構(gòu)建了原核表達載體，并在大腸桿菌BL21中成功誘導表達。祝傳書等克隆了雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）TwSEl和TwSE2基因，具76.18%相似性，TwSEl基因在花中表達量最高，TwSE2基因在花和嫩葉中的表達量最高，均受MeJA誘導上調(diào)表達，上調(diào)幅度TwSEl基因高于TwSE2基因。王學方等對17種大戟科（Euphorbiaceae）植物的SE分析發(fā)現(xiàn)只有蓖麻（Ricinus communis）4和木薯（Manihot esculenta）l的SQE具有信號肽;5個沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，7個只在N末端有跨膜結(jié)構(gòu)域，5個N末端和C末端都有跨膜結(jié)構(gòu)域。此外，在人參（Panaxginseng）、絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）、野三七（Panaxvietnamensisvar.fuscidiscus）、金鐵鎖（Psammosilenetunicoides）等藥用植物也開展了SQE基因的克隆研究。（本研究切入點）目前，未見鐵皮石斛SQE基因的相關(guān)研究報道。（擬解決的關(guān)鍵問題）本課題組通過鐵皮石斛莖和葉的轉(zhuǎn)錄組測序，分析了植物甾醇的生物合成途徑相關(guān)基因，獲得2個帶5末端的SQE基因片段，以此為基礎(chǔ)開展全長cDNA及ORF克隆和表達模式分析。本研究通過已獲得2個帶5末端的SQE基因片段設(shè)計3RACE引物，克隆基因全長cDNA序列和ORF，并分析2個基因在不同營養(yǎng)生長期鐵皮石斛莖和葉中的表達模式，以期為進一步研究鐵皮石斛SQE基因功能及植物甾醇生物合成分子機制和代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為福建冠豸山種源鐵皮石斛，2017年種于亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所溫室大棚，基質(zhì)為松樹皮，光照強度8000～10000lX，空氣相對濕度70%～90%。于不同營養(yǎng)生長期（2018年8月、10月、12月）取鐵皮石斛的莖和葉，每個樣品3重復，超低溫冰箱-80℃保存，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 按照TaKaRa的RNAiso Plus說明提取鐵皮石斛莖、葉的總RNA，檢測RNA的質(zhì)量和濃度。以提取的總RNA為模板，隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA第1鏈。

1.2.2DoSQEl與DoSQE2基因全長cDNA的克隆根據(jù)已經(jīng)獲得的DoSQEl與DoSQE2基因信息設(shè)計用于3'RACE的引物及接頭引物（表1）。取8月、10月、12月鐵皮石斛莖和葉的cDNA各lO uL混合作為模板，用引物3DoSQElFl和dT-adaptor、3DoSQE2Fl和dT-adaptor分別進行PCr.把PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，3DoSQElF2和adaptor、3DoSQE2F2和adaptor進行巢式PCr.反應體系25uL：ddH₂O 8.5uL，上下游引物（10umol·L^-1）各1uL，2×SanTaqPCRMix 12.5uL，模板2ul.PCR反應程序為94℃預變性5min，然后94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，30個循環(huán)，最后72℃延伸lo min.PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，膠回收目的片段，與pMDl9-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，復蘇后涂LB平板（含100mg·L^-1氨芐青霉素），選擇經(jīng)菌落PCR鑒定的陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

1.2.3DoSQEl與DoSQE2基因ORF的克隆根據(jù)DoSQEl與DoSQE2基因全長cDNA序列設(shè)計DoSQEl基因的ORF克隆引物DoSQElF（帶Xpn I酶切位點）與DoSQElR（帶SalI酶切位點）和DoSQE2基因的ORF克隆引物DoSQE2F（帶Kpn Ⅰ酶切位點）與DoSQE2R（帶SalⅠ酶切位點），產(chǎn)物長度分別為1579bp和1645bp（表1）。以2uL混合的cDNA為模板，PCR擴增體系和反應程序同上，延伸時間90s.陽性克隆送去測序。

1.2.4DoSQEl與DoSQE2基因的生物信息學分析

ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析DoSQE/與DoSQE2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，蛋白跨膜區(qū)預測利用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/），二級和三級結(jié)構(gòu)預測使用在線工具SSPro（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）和SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）。采用NCBI的BLASTP搜索DoSQEl與DoSQE2基因編碼蛋白的同源序列及保守結(jié)構(gòu)域，通過MEGA6.0（Neighbor Joining Tree，Bootstrap 1000）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5DoSQEl與DoSQE2基因的表達分析設(shè)計DoSQEl基因引物DoSQEl-F和DoSQEl-R、DoSQE2基因引物DoSQE2-F和DoSQE2-R、內(nèi)參Actin基因引物DoACT-F和DoACT-R（表1）用于熒光定量PCr.把不同月份莖和葉的cDNA濃度定量為200ng·uL^-1。用Roche LightCycler 96檢測DoSQEl與DoSQE2基因在不同生長期鐵皮石斛莖和葉中的表達量。反應體系為：TB Greena Premix Ex Tap Ⅱ（TliRNaseHPlus）10uL，上、下游引物各l uL，cDNA模板2uL，ddH₂O補足20ul.反應程序為：95℃30s;95℃10s，60℃ 20s，45個循環(huán);每個反應設(shè)置3個重復。利用2^△△CT法分析相對表達量，DPS數(shù)據(jù)處理軟件對結(jié)果進行方差分析，多重比較采用新復極差法（Duncan法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoSQEl與DoSQE2基因全長cDNA的克隆

以不同生長期莖和葉的cDNA混合物作為模板，利用3RACE引物進行巢式PCR擴增DoSQEl與DoSQE2基因3末端，DoSQEl與DoSQE2基因分別得到l條特異條帶，約800bp和680bp（圖1-A、C），目的條帶經(jīng)過膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和克隆驗證后送去測序、測序結(jié)果利用DNAMAN V6.0進行序列拼接及ORF預測，獲得DoSQEl基因cDNA序列全長1796bp（GenBank登錄號MTl60182），含有1個1554bp的ORF，編碼517個氨基酸，5末端非翻譯區(qū)24bp，3末端非翻譯區(qū)218bp;DoSQE2基因cDNA序列全長1963bp（GenBank登錄號MTl60183），含有1個1578bp的ORF，編碼525個氨基酸，5末端非翻譯區(qū)127bp，3末端非翻譯區(qū)258bp.

2.2DoSQEl與DoSQE2基因開放閱讀框的克隆

以不同生長期莖和葉的cDNA混合物作為模板，利用擴增ORF的引物擴增DoSQEl與DoSQE2基因的ORF，電泳結(jié)果顯示，DoSQEl與DoSQE2基因分別得到1條約1579bp和1645bp的特異條帶（圖1-B、D），大小與預測一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)過克隆及驗證后送去測序，測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN V6.0比對，結(jié)果表明獲得了DoSQEl與DoSQE2基因ORF，核苷酸序列相似度為79.78%，編碼氨基酸相似度為80.95%。提取陽性克隆的質(zhì)粒pMDl9-T-DoSQEl和pMDl9-T-DoSQE2超低溫冰箱保存。

2.3DoSQEl與DoSQE2蛋白基本性質(zhì)分析

利用ProtParam tool在線分析DoSQEl與DoSQE2蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果表明，DoSQEl蛋白的分子量為56.235kD，理論等電點為8.96，負電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為45，正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為55，不穩(wěn)定系數(shù)是44.92，總平均疏水性是0.084，屬于一種不穩(wěn)定的疏水性蛋白。DoSQE2蛋白的分子量為56.541kD，理論等電點為8.77，負電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為46，正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+LVs）為53，不穩(wěn)定系數(shù)是39.66，總平均疏水性是0.137，屬于一種穩(wěn)定的疏水性蛋白。使用TMHMM Server v.2.0預測DoSQEl與DoSQE2蛋白跨膜區(qū)，結(jié)果顯示（圖2），DoSQEl具有2個跨膜區(qū)，分別在4～22aa和55～72aa;DoSQE2只有1個跨膜區(qū)，在5～23aa.DoSQEl蛋白在204～4768a、DoSQE2蛋白在211～4848a處含有鯊烯環(huán)氧酶結(jié)構(gòu)域，E值分別為1.32×10^-157和3.04X10^-154。

2.4DoSQEl與DoSQE2蛋白空間結(jié)構(gòu)分析

SSPro在線預測DoSQEl與DoSQE2蛋白二級結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖3）表明，DoSQEl和DoSQE2形成無規(guī)則卷曲氨基酸殘基分別有207（40%）和231（44%）個，形成α螺旋氨基酸殘基分別為232（44.9%）個和216（41.1%）個，形成β折疊氨基酸殘基都是78個，分別占15.1%和14.9%。通過SWISS-MODEL在線預測，DoSQEl與DoSQE2蛋白3D結(jié)構(gòu)如圖4，同源建模的模板都是6c6n.1.A，一致性分別為48.07%和47.37%，建模范圍在51～496和78～504位氨基酸殘基，覆蓋率85%和80%。

2.5DoSQEl與DoSQE2蛋白同源性系統(tǒng)進化分析

使用BLASTP檢索DoSQEl與DoSQE2蛋白的同源序列，結(jié)果表明：DoSQEl蛋白的氨基酸與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris，XP 020599860.1）、高粱（Sorghum bicolor，XP 002468222.1）和油棕（Elaeisguineensis，XP 010936193.1）SQE氨基酸序列的相似度分別為86%、85%和84%。DoSQE2蛋白的氨基酸與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris，XP 020579136.1）、小米（Setaria itaBca，XP 004985122.1）和玉米（Zeamays，ONL95392.1）SQE氨基酸序列的相似度分別為87%、86%和86%。將DoSQEl與DoSQE2蛋白的氨基酸序列與其他15個物種的SQE氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果（圖5）顯示，蘭科植物的鐵皮石斛和姬蝴蝶蘭聚為一類，DoSQEl與姬蝴蝶蘭的XP 020599860.1親緣關(guān)系最近，DoSQE2與姬蝴蝶蘭的XP 020579136.1親緣關(guān)系最近。

2.6DoSQEl與DoSQE2基因表達分析

利用qRT-PCR檢測DoSQEl和DoSQE2基因在鐵皮石斛莖和葉中的表達模式，結(jié)果（圖6）表明，莖和葉中都能檢測到2個基因的表達，相同時間葉的表達量顯著高于莖。DoSQEl基因在鐵皮石斛莖和葉中的表達量8月份最高，lo月份次之，12月份最低。DoSQE2基因在鐵皮石斛莖和葉中的表達量10月份最高，8月份次之，12月份最低。

3 討論與結(jié)論

鯊烯單加氧酶是三萜類和甾醇類化合物生物合成關(guān)鍵酶。本研究克隆了鐵皮石斛DoSQEl和DoSQE2基因，核苷酸序列相似度為79.78%，編碼氨基酸相似度為80.95%，含有鯊烯環(huán)氧酶結(jié)構(gòu)域。DoSQEl與野三七的PvfSE一樣具有2個跨膜區(qū);DoSQE2與雷公藤的TwSE2一樣僅有1個跨膜區(qū)。由于DoSQEl和DoSQE2跨膜區(qū)個數(shù)不同，推測蛋白在膜內(nèi)和膜外的結(jié)構(gòu)不一樣，催化活性也存在差異。

不同植物具有不同的SQE基因拷貝數(shù)，不同SQE基因組織表達模式也具有差異。雷公藤TwSEl基因表達量最高的是花，最低的是根;TwSE2基因表達量最高的是花和嫩葉，最低的是老葉。DEVARENNE等研究發(fā)現(xiàn)，提高或降低SQE基因的表達量，三萜皂苷的生成量也隨之增加或減少。CHOI等研究表明，茉莉酸甲酯（MeJA）誘導提高SQE基因的表達，增加了三萜的合成量。鐵皮石斛DoSQEI和DoSQE2基因在莖和葉都有表達，葉的表達量顯著高于莖。DoSQEl基因從8月份到12月份表達量逐漸降低。DoSQE2基因表達量從8月份到12月份是先升高后降低。DoSQEl和DoSQE2基因表達模式不同，推測兩者在鐵皮石斛營養(yǎng)生長過程的催化活性存在差異。

本研究克隆了鐵皮石斛DoSQEl和DoSQE2基因，分析了營養(yǎng)生長期的表達模式，為進一步研究其在鐵皮石斛甾醇類化合物生物合成中的功能奠定基礎(chǔ)。