張偉　吳曉衛(wèi)　姚彥紅　張芬芬　周曉倫

摘要：從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)α-淀粉酶的耐鹽性菌株NWU-8，通過形態(tài)學、生理生化和16S rRNA基因序列分析，將NWU-8菌株鑒定為Halorubrum sp.，初始淀粉酶活力為32 U/mL。為提高該菌株產(chǎn)α-淀粉酶的能力，采用He-Ne激光照射手段對其進行誘變育種，所獲突變株NWU-8-14產(chǎn)α-淀粉酶活力達到138 U/mL，產(chǎn)酶活力提升331%。此外，在鹽濃度高達35%時，其α-淀粉酶活力仍然保持80 U/mL。NWU-8-14作為一種高產(chǎn)淀粉酶的噬鹽菌在食品發(fā)酵及環(huán)境保護方面有廣闊的應用前景。

關鍵詞：淀粉酶;嗜鹽菌;誘變;酶活力

中圖分類號：TS201 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020） 16-0130-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.029

耐鹽性α-淀粉酶是在含鹽量較高的條件下能水解淀粉的酶類，廣泛用于高鹽環(huán)境下淀粉質(zhì)原料的加工，如醬油的釀造[1]、工業(yè)副產(chǎn)品的加工[2]和垃圾的處理[3]等。特別是在高鹽稀態(tài)醬油釀造過程中，由于鹽水濃度的影響會導致普通微生物酶類失活而影響其水解和發(fā)酵作用，而在此過程中添加耐鹽性淀粉酶可有效提高淀粉和還原糖的轉(zhuǎn)化率，從而使原材料中的淀粉得以有效利用。其中，微生物淀粉酶以其易于大規(guī)模發(fā)酵和純化等特點而被人們視為工業(yè)淀粉酶的重要來源。迄今為止，已有關于耐酸性淀粉酶產(chǎn)生菌、耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌等的大量報道[4，5]，但是鮮有關于耐鹽性淀粉酶產(chǎn)生菌應用于工業(yè)生產(chǎn)的報道。

為獲得遺傳性狀穩(wěn)定的耐鹽性α-淀粉酶產(chǎn)生菌，本研究從陜西省定邊縣鹽湖土壤分離得到1株耐鹽性產(chǎn)淀粉酶的菌株NWU-8，并對其進行形態(tài)特征、生理生化和16SrRNA鑒定，結(jié)果顯示該菌株為Halorubrum sp.。為提高其耐鹽能力和產(chǎn)淀粉酶活力，運用He-Ne激光對其進行誘變育種，獲得1株高產(chǎn)淀粉酶的耐鹽性菌株NWU-8-14，以期為耐鹽性淀粉酶產(chǎn)生菌的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)及在食品發(fā)酵和環(huán)境保護中的進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1） 培養(yǎng)基a：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 100g，去離子水 1 000 mL，pH 7.5。

2） 培養(yǎng)基b：酸水解酪蛋白5g，酵母浸膏12g，蛋白胨6g，可溶性淀粉10 g，檸檬酸三鈉3 g，KCl 3 g，MgS04·7H20 18 g，F(xiàn)eS04·7H20 0.001 g，NaCl 100 g，去離子水 1000 mL，pH 7.5。

3） 培養(yǎng)基c：玉米粉30 g，玉米漿30 g，CaCl2 13 g，Na2HP043 g，（NH4）2S04 4 g，去離子水 1 000 mL，pH7.5。以上培養(yǎng)基均在1×105 Pa滅菌30 min。

1.1.2 土樣采自陜西省定邊縣鹽湖土壤。

1.2方法

1.2.1 嗜鹽菌株分離 所采集的土壤樣品經(jīng)過2周自然干燥，取10g 土壤到90 mL無菌水中，置于搖床上150 r/min振蕩30 min充分混勾，得到10-1 土樣稀釋液，再依次稀釋到1×10-4/1×10-5和1×10-6，及取0.2 mL稀釋液均勻涂布在培養(yǎng)基a平板上，30℃倒置培養(yǎng)72 h[6]。挑取單菌落反復劃線，確保得到純單菌并置于斜面（培養(yǎng)基a）保存。

1.2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選 選取斜面保存菌株接種于b培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)7 d，用盧氏碘液染色。對應菌株接入c液體培養(yǎng)基中進行37℃搖瓶發(fā)酵72 h，對發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速6 000 r/min，低溫離心時間10 min，取上清液測定酶活力。根據(jù)菌落直徑和染色圈大小，計算染色圈直徑/菌落直徑[6]，初步評價各菌株產(chǎn)淀粉酶的能力，確定產(chǎn)淀粉酶效果最佳菌株。每個操作重復3次。

1.2.3 菌株形態(tài)學與生理生化鑒定 采用顯微鏡觀察菌體形態(tài)，參照《微生物學試驗手冊》[7]《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]進行生理生化鑒定。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析提取菌株的總基因組DNA，以此為模板，利用細菌16SrDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R （5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3）進行PCR擴增。PCR反應體系25μL，熱循環(huán)參數(shù)如下：94 ℃預變性 3 min，94 ℃變性 1 min，55℃退火 1min，72 ℃延伸 2 min，循環(huán) 30 次，72℃延伸 10 min。瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞并進行菌落PCR驗證，測序由西安交通大學第一附屬醫(yī)院完成。序列通過NCBI比對分析，采用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[9]。

1.2.5 He-Ne激光誘變育種

1） 菌懸液制備。將培養(yǎng)7 d的斜面用無菌水沖洗，沖洗液盛放在已滅菌的含有玻璃珠的三角瓶中，在往復式搖床上150 r/min、37℃充分振蕩培養(yǎng)30min，使菌株充分分散，誘變處理之前將菌懸液稀釋至 1×106個/mL。

2） He-Ne激光誘變。用滅菌的移液管吸取2mL菌懸液，裝入無菌試管（直徑1 cm，壁厚0.1 cm）中，使用He-Ne激光器（波長為632.8 nm，光斑直徑為1.5 mm）照射，照射距離為25 cm，輸出功率為15 mW，照射時間分別設置為5、10、15、20、25和30min，原菌懸液作為空白對照組每個試驗組均重復3次[10，11]。

3） 突變培養(yǎng)及性能檢測。用滅菌的移液管吸取1 mL各試驗組照射后的菌懸液，移入盛有無菌水的試管中，充分振蕩混勻后進行梯度稀釋，并涂布于初篩平板，觀察菌落形態(tài)及菌落生長，原菌懸液為空白對照，試驗重復3次。

統(tǒng)計初篩培養(yǎng)基上的平均菌落數(shù)，計算致死率[12]。若誘變后能夠生長且菌落形態(tài)較大者為正突變株，反之，則為負突變株。

正變率=正突變株菌落數(shù)/誘變前菌株數(shù)×100% （1）

致死率=（對照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù)）/對照組菌落數(shù)×100%（2）

1.2.6 淀粉酶活性測定

1） 淀粉酶的初提。將1mL（0D值為2.1）菌液分別接種于25 mL基礎培養(yǎng)基（5%～20%的鹽濃度，pH 8.5），220 r/min，28 ℃培養(yǎng) 5 d。取 2 mL 培養(yǎng)液，6 000 r/min低溫離心10 min，上清液即作為酶的初提液，用于活性檢測[13]。

2） 淀粉酶活力測定。采用3，5-二硝基水楊酸比色（DNS）法測定淀粉酶活力[14，15]。

3） 酶活力的定義與計算。將37℃，20 min內(nèi)1mL酶初提物產(chǎn)生1μg葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位[16]。

1.2.7 野生菌株和突變株所產(chǎn)淀粉酶耐鹽性比對在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加濃度為10%、15%、20%、25%、30%、35% 的 NaCl，并且以不含 NaCl 的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，將其滅菌后，分別接入等量的突變菌株和野生菌株，發(fā)酵后測定其酶活，比較野生菌和突變株所產(chǎn)淀粉酶的耐鹽能力。

2結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶嗜鹽菌株分離篩選

根據(jù)a平板上菌落生長情況，選出能夠生長的44株菌，經(jīng)過b平板上產(chǎn)淀粉酶篩選，用盧氏碘液染色和c培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵測定其淀粉酶活力，獲得在pH 7.5時具有產(chǎn)淀粉酶的菌株5株（表1）。其中，NWU-8菌株染色圈直徑最大，為2.867 cm，染色圈直徑/菌落直徑比值最大，為2.182，酶活力最大，說明NWU-8是產(chǎn)淀粉酶能力最強的菌株，挑選其作為本試驗的出發(fā)菌株進一步研究。

2.2形態(tài)學與生理生化鑒定

NWU-8菌株在a平板上形成的菌落呈乳白色，正反面顏色相同，菌落邊緣整齊，中間有凸起，表面有皺紋，光學顯微鏡下觀察NWU-8菌株革蘭氏染色為陽性，菌體為桿狀，有芽孢，直徑小于1μm。生理生化反應見表2。

2.3 16S rDNA基因序列分析

提取NWU-8菌株的總DNA進行PCR擴增，凝膠電泳回收擴增序列，得到一段1484 bp長度的16S rDNA，所獲序列提交Genbank（Genbank登錄號KP729620）進行BLAST分析，通過Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)NWU-8菌株與Halorubrum sp. YC-16同源性達到100%，由此可將NWU-8 菌株鑒定為 Halorubrum sp.。

2.4誘變育種結(jié)果分析

菌株NWU-8經(jīng)過He-Ne激光誘變之后突變結(jié)果如圖2所示，對比致死率與正突變率，確定菌株最佳誘變時間為20 min。反復對NWU-8菌株進行激光誘變，將突變株點種到b平板上37℃恒溫培養(yǎng)7 d，用盧氏碘液染色。觀察菌落的生長情況和菌落直徑、染色圈直徑的大小，比較染色圈直徑/菌落直徑的比值。挑取染色圈直徑大，染色圈直徑/菌落直徑比值大的突變株進行液體搖瓶發(fā)酵，檢測突變株產(chǎn)淀粉酶的能力（表從表3中可以看出，NWU-8-14菌株染色圈直徑最大，為3.206 cm，單株菌落直徑較大，為1.316 cm，染色圈直徑/菌落直徑比值最大，為2.436，產(chǎn)酶活力為138 U/mL，與NWU-8菌株相比產(chǎn)酶能力提高331%，對比出發(fā)菌株NWU-8，突變株無論是從菌株直徑大小、染色圈直徑大小、染色圈直徑/菌落直徑比值以及酶活力都有較大提高，說明高產(chǎn)突變株選育達到了試驗目的，可將NWU-8-14菌株作為誘變育種后的高產(chǎn)菌株。

2.5 突變株傳代培養(yǎng)檢測穩(wěn)定性

將突變株進行50代傳代培養(yǎng)，每隔5代檢測1次菌株所產(chǎn)淀粉酶活力，結(jié)果見表4。經(jīng)過50代后，根據(jù)單樣本檢驗分析，P均大于0.05，說明各代之間產(chǎn)酶能力無顯著差異，表明NWU-8-14菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。

2.6突變株所產(chǎn)淀粉酶耐鹽性測定將挑選出的突變株NWU-8-14和野生菌株NWU-8分別加入含有不同濃度NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測菌株及所產(chǎn)淀粉酶的耐鹽度。35℃，180r/min發(fā)酵3 d后測定其酶活力，所得結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看到，野生菌NWU-8雖然能夠耐受一定濃度的鹽分，但當鹽濃度升至25%時，所產(chǎn)淀粉酶就幾乎沒有了活性;而突變株NWU-8-14相對比親本其耐鹽能力有了較大提升，所產(chǎn)淀粉酶一直保持良好的活性，盡管在鹽濃度高達35%時，仍舊保持較好的酶活力。

3討論與結(jié)論

研究表明，嗜鹽菌所產(chǎn)的酶應具有更廣泛的耐鹽堿特性，應用范圍也更寬泛。其所產(chǎn)的淀粉酶比普通淀粉酶在鹽堿環(huán)境中具有更好的穩(wěn)定性。目前，有研究報道證實了此結(jié)論，主要為Bacillus subtilis[17]、Haloarcula hispanica[18]、Halobacterium halobium[19]、Halomonias meridiana [20]、B. dipsosauri [21]、B. lichenifor-mis[22]等。

本研究從定邊縣鹽湖的土壤中分離篩選出1株產(chǎn)淀粉酶的噬鹽性菌株。經(jīng)形態(tài)、生理生化及分子系統(tǒng)學研究，該菌被鑒定為Halorubrum sp.。為提高該菌株的耐鹽性和產(chǎn)淀粉酶的能力，對其進行了He-Ne激光誘變，并選育出一株耐鹽性和產(chǎn)酶能力均明顯提升的突變株NWU-8-14，該突變株菌株對鹽濃度耐受性可達到35%;此外，其產(chǎn)酶活力達到138 U/mL，產(chǎn)酶能力大大提高，且經(jīng)過50代傳代檢測，菌株遺傳穩(wěn)定性良好。

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收稿日期：2019-11-10

基金項目：甘肅省高等學校創(chuàng)新能力提升項目（2019B-203）

作者簡介：張偉（1984-），男，甘肅慶陽人，講師，主要從事微生物物種資源研究，（電話）18293373738（電子信箱）274591224@qq.com;通信作者，周曉倫，講師，主要從事土壤微生物研究，（電子信箱）610253095@qq.com。