云 霞 陳 琪 周好樂 楊 錚 塔 娜 于泊洋 張 巖 張信來 劉陶迪**

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（內(nèi)蒙古呼和浩特010059）；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

哺乳動物青春期后睪丸開始發(fā)育，生精細(xì)胞增殖分化，啟動生精過程。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，10%的已婚夫婦患有不育癥,其中男性因素約占30-50%[1]。男性不育癥是人類生殖研究的重要課題。導(dǎo)致男性不育的原因復(fù)雜，其中精子發(fā)生過程中，由諸多基因參與的調(diào)控機制異常是重要的因素[2，3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，揭示精子發(fā)生的分子調(diào)控機制已經(jīng)成為男性不育研究領(lǐng)域的熱點。

CXCL6(C-X-C motif ligand 6)又名粒細(xì)胞趨化蛋白 -2(granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2)，最初在骨肉瘤細(xì)胞株上被發(fā)現(xiàn)，是趨化因子的重要成員。研究表明CXCL6具有趨化粒細(xì)胞、參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用[4]。此外CXCL6促進血管生成，與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雌性子宮中的研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，CXCL6與羊膜腔中的免疫反應(yīng)以及抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的移行和入侵有關(guān)[6，7]。本實驗檢測CXCL6基因在2～65日齡大鼠睪丸組織中的表達,進一步探討CXCL6基因在精子發(fā)生過程中的作用。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

將購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心，清潔級，10周齡左右的Wistar大鼠在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物中心飼養(yǎng)。將一只雄性和兩只雌性鼠合籠,自然交配,保證充足的飼料和干凈的飲水供給，每周換墊料，第8天后分籠。每日觀察雌鼠3次,將出生當(dāng)天的鼠，計數(shù)為第1天，即1日齡，編號飼養(yǎng)。將2～65日齡，21個不同時間節(jié)點，每個時間節(jié)點3只不同窩別的，總計63只雄性Wistar大鼠頸椎脫臼法處死后，取下睪丸組織，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

（二）實驗試劑

總RNA提取試劑盒(DP419)購自天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR（RT-PCR），使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒，購自大連寶生物公司。引物由上海生物工程公司合成提供。免疫組織化學(xué)染色使用UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒（鼠/兔）(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Kit-9710)，用DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Kit-0014）顯色。 兔抗大鼠 CXCL6（GCP-2）抗體（JM7139）購于北京嘉美生物技術(shù)有限公司。HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購于Abcam公司。

二、實驗方法

（一）總RNA提取

取各時間節(jié)點的50mg睪丸組織，按照總RNA提取試劑盒說明書操作步驟，提取總RNA。用紫外分光光度儀測定RNA濃度和純度。RNA濃度測定3次，取平均值。RNA純度以A260/A280比值在1.95～2.10之間為合格?？俁NA提取物管-80℃冰箱保存。

（二）RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

根據(jù)各樣品總RNA的濃度和純度值，將樣品制成體積 30μl，濃度為 0.2μg／μl的稀釋液，制作轉(zhuǎn)錄體系A(chǔ)液和B液。A液10μl，包括樣本總RNA 4.0μl，Oligo-dt(10umol/L)1.0μl，加入 RNase-Free dH2O 至 10μl。B 液 l0μl， 包 括 5 ×M-MLVbuffer 4.0μl，dNTP Mixture(10mmol/L)2.0μl，RNase Inhibiter(40U/μl)1.0μl，M-LV Reverse Transcriptase (5U/μl)0.5μl，RNase-Free H2O 2.5μl。按照說明書操作步驟，混合A液與B液，制備成20μl反應(yīng)體系，42℃水浴60分鐘，72℃水浴10分鐘進行mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄成的cDNA-20℃冰箱保存。

表1 CXCL6基因引物列表

（三）Real-time PCR

使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒進行，以cDNA樣本為模版對CXCL6基因進行Real-time PCR反應(yīng)。CXCL6基因引物通過Primer5軟件設(shè)計（表1）。根據(jù)試劑盒說明及引物的條件設(shè)定RT-PCR的反應(yīng)程序為： 預(yù)變性 95°C 10 min;95°C 30s；95°C 5s；55°C 30s；72°C 34s，擴增40個循環(huán)。反應(yīng)體系模版分別來自三組不 同 窩 別 出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日齡的 21 個時間節(jié)點的大鼠睪丸組織cDNA。每個時間節(jié)點的樣品重復(fù)檢測兩管，以GAPDH做為內(nèi)參對照，以H2O做為陰性對照。用Ct方法分析CXCL6 mRNA的表達量，結(jié)果用基因mRNA相對表達倍數(shù)表示。計算方法用2-ΔΔCt法，數(shù)據(jù)和圖表使用Microsoft Excel分析。

（四）免疫組織化學(xué)染色

取65日齡大鼠的睪丸組織石蠟切片,烤片、脫蠟水化。PBS洗三次，每次5min，微波15 min進行組織抗原修復(fù)。切片滴加過氧化酶抑制劑室溫處理10 min之后PBS洗三次，每次3min。滴加兔抗大鼠CXCL6（GCP-2）抗體（1：80），濕盒中 4℃過夜，以 PBS 替代一抗做為空白陰性對照。次日，PBS洗三次，每次3min，滴加HRP-羊抗小鼠／兔IgG,室溫孵育10min。PBS淋洗后，滴加H2O2-DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。在顯微鏡下觀察，拍照。

結(jié) 果

一、Real-time PCR檢測CXCL6基因表達

引物的溶解曲線重合度高，可知其特異性好（圖1 A，C），擴增曲線在PCR平臺期幾乎重合（圖1 B，D）。

圖1 CXCL6和Gapdh的基因擴增熔解曲線與擴增曲線

通過Real-time PCR反應(yīng)檢測三組不同窩別來源，出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日齡，21 個不同時間節(jié)點的大鼠睪丸組織中的CXCL6基因表達。三組不同窩別來源的大鼠睪丸組織中，CXCL6 mRNA水平表達變化趨勢基本相同，在大鼠出生的第2到65天呈動態(tài)變化。

CXCL6 mRNA表達在出生后第2天呈高表達，隨后開始迅速下降，在第8天下降到最低值，并且一直持續(xù)到第16天。從第20天起迅速線性升高表達，在第29天時達到整個發(fā)育過程的最高值，之后開始下降。第35天起CXCL6基因的表達再次呈現(xiàn)升高趨勢，在第45天形成一個小高峰表達之后，維持一定的表達量持續(xù)至第 65 天（圖 2）。

圖2 CXCL6基因在3組不同窩別出生2至65日齡大鼠睪丸組織中mRNA的相對表達量

圖3 65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學(xué)染色

二、免疫組織化學(xué)染色檢測CXCL6蛋白在65日齡大鼠睪丸組織中的表達

65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學(xué)染色顯示，曲細(xì)精管內(nèi)可見CXCL6蛋白陽性表達的細(xì)胞。在精母細(xì)胞邊緣和圓形精子以及曲細(xì)精管管腔的成熟精子處均呈現(xiàn)陽性信號（圖3）。

討 論

睪丸的曲細(xì)精管是精子生成的場所。精子發(fā)生包括精原干細(xì)胞的增殖與分化，減數(shù)分裂和成熟精子形成等三個階段[8]。每個階段都是多基因參與的復(fù)雜的調(diào)控過程。Wrobel G等[9]研究表明，大鼠出生后1-8天以精原干細(xì)胞的自我增殖和分化為主；出生后14天左右開始減數(shù)分裂，出現(xiàn)初級精母細(xì)胞；出生20天之后進入圓形精子發(fā)生階段，此時第二次減數(shù)分裂完成，圓形精子首次出現(xiàn)；出生35天后完成圓形精子向長形精子的變形，形成成熟的精子；出生56天后大鼠性成熟，達到成年狀態(tài)[10]。

本研究對大鼠出生后第 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 天的睪丸組織進行CXCL6基因表達檢測。觀察到CXCL6基因在大鼠精子發(fā)生過程中，轉(zhuǎn)錄水平表達呈動態(tài)變化。在大鼠出生后第2天CXCL6基因mRNA呈高表達，隨后迅速下降，在第8天下降到最低值，一直持續(xù)到第16天。根據(jù)Wrobel G等和劉陶迪[11]等的研究結(jié)果，該時期是大鼠精原干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵時期，推測CXCL6基因可能通過調(diào)低表達，參與精原干細(xì)胞的增殖過程。

從第20天起CXCL6基因表達量迅速線性升高，在第29天時可達到整個發(fā)育過程的最高值，之后開始下降。研究表明大鼠出生20天之后進入圓形精子發(fā)生階段，此時第二次減數(shù)分裂剛完成，圓形精子首次出現(xiàn)[12]。第20天后CXCL6 mRNA水平升高，提示減數(shù)分裂以后，CXCL6可能通過高表達參與與圓形精子的形成。從第35天到大鼠性成熟，圓形精子細(xì)胞核發(fā)生聚縮和塑性，經(jīng)過復(fù)雜的變態(tài)發(fā)育，向長形精子變形，形成成熟的精子。第35天可見CXCL6基因的表達再次呈現(xiàn)升高趨勢，在第45天形成一個小高峰之后，維持一定的表達量持續(xù)至第65天。由此推測CXCL6基因可能與圓形精子細(xì)胞變態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L形精子以及長形精子的成熟有關(guān)。65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學(xué)染色顯示曲細(xì)精管內(nèi)可見CXCL6蛋白陽性表達的細(xì)胞。CXCL6蛋白位于精母細(xì)胞邊緣和圓形精子處，提示CXCL6在減數(shù)分裂后期表達，支持該基因參與圓形精子形成的推斷。CXCL6蛋白在長形精子處表達也提示CXCL6基因在長形精子成熟的過程中發(fā)揮重要的作用。

臨床研究提示男性生殖能力降低與頂體發(fā)生及頂體反應(yīng)異常有關(guān)[13]。 田洪艷[14]等報道，圓形精子細(xì)胞期是頂體發(fā)生的重要時期，此期內(nèi)圓形精子細(xì)胞核變形的同時，頂體從無到有，逐漸變大，從圓形變成帽形，經(jīng)歷復(fù)雜的演變，形成正常結(jié)構(gòu)和功能的頂體。頂體伴隨著精子形成過程，也對精子形成過程發(fā)揮重要的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL6陽性信號表達部位與頂體發(fā)生的部位相似[16]。實時定量PCR檢測結(jié)果也支持CXCL6基因在減數(shù)分裂之后圓形精子形成階段升高表達，可達到整個精子發(fā)生過程的最高峰值，提示CXCL6基因可能通過與頂體形成相關(guān)，對精子形成產(chǎn)生影響，具體的作用機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究認(rèn)為CXCL6基因可能參與精原干細(xì)胞的增殖；可能與頂體形成相關(guān)，在圓形精子的形成以及精子成熟的過程中發(fā)揮作用，可能是大鼠精子發(fā)生過程，分子調(diào)控機制中的重要環(huán)節(jié)，為揭示該基因男性生殖相關(guān)的作用提供了初步的線索。