趙曉海 王成志 孔建兵 鮑躍兵 邱永偉 賴瑞南

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的病理類型，占甲狀腺癌的80%以上，多見于年輕女性，患者常出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移以及局部侵襲、復(fù)發(fā)[1-2]。腫瘤直徑超過1 cm的PTC患者大多伴有中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，目前臨床診斷困難，因此，治療效果往往不及預(yù)期[3]。miR-486-3p作為一種常見的抑癌miRNA，在甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)[4]。研究發(fā)現(xiàn)PTC細(xì)胞中miR-486-3p表達(dá)下調(diào)，能夠促進(jìn)NF-κB信號通路的活性，加速PTC細(xì)胞的侵襲，促進(jìn)PTC疾病進(jìn)展[5]。此外，miR-486-3p表達(dá)下調(diào)與乳腺癌前哨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)，能夠作為乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移診斷的分子標(biāo)志物[6]。然而，目前鮮有關(guān)于miR-486-3p與PTC淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制的研究?；诖耍狙芯繉TC樣本中miR-486-3p的差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并探討其靶基因差異表達(dá)情況及臨床意義，以期為其在PTC中的深入研究提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和整理 檢索腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/），下載PTC相關(guān)的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，其中腫瘤樣本502例、癌旁正常組織樣本4例。

1.2 差異表達(dá)分析 使用limma R包對腫瘤標(biāo)本與癌旁組織表達(dá)譜進(jìn)行差異分析，選擇log2FC絕對值＞1，P＜0.05為篩選條件。將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化并導(dǎo)出相應(yīng)圖表。

1.3 差異基因功能及信號通路富集分析 使用ClusterProfiler R包對差異表達(dá)基因富集，隨后進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋，繪制GO聚類圖。使用ggplot2 R包繪制GO二級分類柱形圖及KEGG注釋統(tǒng)計(jì)圖。

1.4 靶基因預(yù)測并與差異表達(dá)基因取交集 采用Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）與 miRDB（http://mirdb.org/）在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測與miR-486-3p存在結(jié)合序列的靶基因，將得到的miR-486-3p差異表達(dá)基因與兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中預(yù)測到的靶基因取交集，繪制韋恩（Venn）圖。

1.5 生存分析 保留TCGA數(shù)據(jù)集中包含生存資料的病例，根據(jù)中位數(shù)將患者分為基因高、低表達(dá)組。通過Survival R包對樣本進(jìn)行生存分析，繪制Kaplan-Meier生存曲線，并計(jì)算HR值。

2 結(jié)果

2.1 miR-486-3p差異表達(dá)基因分析 對502例腫瘤樣本與4例配對樣本進(jìn)行差異分析，根據(jù)limma R包的分析結(jié)果，差異基因表達(dá)火山圖見圖1（插頁），差異基因聚類分析熱圖見圖2（插頁）。結(jié)果顯示，74個(gè)基因上調(diào)，25個(gè)基因下調(diào)，上調(diào)、下調(diào)差異最顯著的各20個(gè)基因及相關(guān)信息見表1。

表1 篩選出的miR-486-3p差異表達(dá)基因

續(xù)表

圖1 miR-486-3p差異表達(dá)基因的火山圖

圖2 miR-486-3p差異表達(dá)基因聚類分析熱圖

2.2 GO功能注釋 使用ClusterProfiler R包對差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞成分、分子功能及細(xì)胞組分中的條目進(jìn)行注釋。選取P值最小前10個(gè)上下表達(dá)的功能條目進(jìn)行標(biāo)示，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因多與細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)發(fā)育、ERK1/2通路等功能調(diào)控相關(guān)，見表 2、圖 3（插頁）。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集二級類別柱形圖

2.4 差異表達(dá)基因PTC患者的生存分析結(jié)果 將TCGA數(shù)據(jù)庫中PTC患者的臨床信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，發(fā)現(xiàn)miR-486-3p表達(dá)與患者的預(yù)后具有相關(guān)性，miR-486-3p低表達(dá)的PTC患者總生存率低于高表達(dá)的患者（P＜0.05），生存曲線見圖 5（插頁）。

圖4 差異基因的KEGG注釋統(tǒng)計(jì)圖

圖5 miR-486-3p高、低表達(dá)的PTC患者的生存曲線比較

2.3 差異基因的KEGG富集分析結(jié)果 PTC涉及相關(guān)通路主要有病毒感染、細(xì)胞周期、泛素化、蛋白水解、p53信號通路、細(xì)胞衰老等，見圖4（插頁）。

2.5 miR-486-3p靶基因預(yù)測與差異表達(dá)基因取交集 采用Targetscan、miRDB分別預(yù)測到miR-486-3p的5 263、941個(gè)靶基因，與miR-486-3p差異表達(dá)的15 128個(gè)mRNA取交集，得到包含689個(gè)基因的集合，見圖6，差異最明顯的前10個(gè)靶基因信息見表3。

3 討論

miRNA是由19～24個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，可以靶向互補(bǔ)mRNA來發(fā)揮調(diào)控基因的表達(dá)的功能，miRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程，miRNA的模擬物已被證明在癌癥的治療中具有巨大潛力[7-8]。本研究對PTC中的表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究了miR-486-3p在PTC中的表達(dá)及其靶基因分布情況，以期為PTC患者的臨床診治提供幫助。

本次分析共篩選出99個(gè)差異表達(dá)基因，其中74個(gè)基因上調(diào)，25個(gè)基因下調(diào)，GO注釋發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因多與細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)發(fā)育、ERK1/2通路等功能調(diào)控相關(guān)，PTC差異通路主要涉及病毒感染、細(xì)胞周期、泛素化、蛋白水解、p53信號通路、細(xì)胞衰老等。研究表明多種miRNAs的表達(dá)失調(diào)可影響靶mRNA穩(wěn)定性及介導(dǎo)翻譯抑制。miRNA通過參與組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞周期、免疫功能等生物過程來介導(dǎo)PTC淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生[9]。除此之外，部分miRNAs可直接靶向p53來誘發(fā)BRAF突變，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡從而參與PTC 的發(fā)生[9-10]。

表2 差異表達(dá)基因GO富集分析

圖6 miR-486-3p差異表達(dá)基因與靶基因重疊的Venn圖

本研究還發(fā)現(xiàn)miR-486-3p低表達(dá)的PTC患者總生存率高，即miR-486-3p高表達(dá)的PTC患者預(yù)后不良。miR-486-3p的靶基因預(yù)測結(jié)果顯示LRP4、SRCIN1、HCN4、HPCAL4、SERPINA1、SLC34A2、SERINC2、GRM4、CTXN1、FIBCD1 可能是 miR-486-3p 在PTC中的靶點(diǎn)。Zhou等[11]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)LRP4作為潛在的PTC治療靶標(biāo)，可上調(diào)PI3K磷酸化水平，增強(qiáng)PTC的增殖、遷移和侵襲能力。Zhang等[12]報(bào)道了SRCIN1作為新發(fā)現(xiàn)的Src結(jié)合蛋白，可通過C端Src激酶結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)Src活性，SRCIN1通過介導(dǎo)細(xì)胞G0/G1周期停止及細(xì)胞分化，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲的能力。SLC34A2通過結(jié)合肌動(dòng)蛋白的復(fù)合結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)PTC細(xì)胞侵襲，促進(jìn)PTC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[13]。上述基因均在PTC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵作用，作為miR-486-3p的靶基因，筆者猜想miR-486-3p可能會(huì)通過靶向調(diào)控上述基因的表達(dá)來參與PTC的發(fā)生、發(fā)展過程，其具體調(diào)控的分子機(jī)制可為后續(xù)研究的方向。除此之外，有報(bào)道稱，miR-486-3p在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，miR-486-3p可作為腫瘤標(biāo)志物，輔助肺癌早期診斷以及食管鱗癌、肌肉浸潤性膀胱癌患者的預(yù)后評估[14-16]。miR-486-3p在喉鱗狀細(xì)胞癌中會(huì)受到circFLNA的競爭性結(jié)合而表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致miR-486-3p調(diào)控FLNA蛋白的能力增強(qiáng)，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移發(fā)生[17]。這些研究從多個(gè)方面輔證了本研究的結(jié)論，即miR-486-3p通過調(diào)控下游靶基因參與PTC的發(fā)生、發(fā)展。

表3 miR-486-3p靶基因預(yù)測與差異表達(dá)基因取交集

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法綜合分析了miR-486-3p的差異表達(dá)及臨床意義，發(fā)現(xiàn)miR-486-3p可在PTC中參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，且低表達(dá)miR-486-3p的PTC患者預(yù)后不良，這提示miR-486-3p可能作為抑癌基因及生物標(biāo)志物在PTC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。