王春雷 魏曉炎 邵國良

近年來，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率不斷上升，已經(jīng)成為全球人類的一個主要死亡原因。肝癌位居惡性腫瘤死亡原因第3位，雖然手術切除治療能夠緩解癌癥的發(fā)展，但患者術后5年生存率仍較低[1]。而化療因受腫瘤普遍存在的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）和藥物嚴重不良反應等原因限制，仍缺乏理想的效果。MDR是指惡性腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥的同時，對其他從未接觸過的、結構和作用機制完全不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生抗藥性[2]。目前仍欠缺能有效克服腫瘤MDR的策略，如何逆轉MDR已經(jīng)成為抗腫瘤研究領域亟待解決的問題之一。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種必需的ω-3不飽和脂肪酸，是細胞膜的關鍵成分，在脊椎動物大腦功能中起著重要作用[3]。以DHA為代表的ω-3不飽和脂肪酸對惡性腫瘤的發(fā)生和轉歸有明顯影響，研究表明ω-3不飽和脂肪酸在逆轉腫瘤MDR方面具有突出的潛在應用價值。Gelsomino等[4]發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸能通過下調(diào)膽固醇的合成和改變抗去污劑膜成分從而對結腸癌耐藥細胞具有化學敏感性。但ω-3不飽和脂肪酸對肝癌MDR的影響尚鮮見報道，影響機制也不明確，如何利用ω-3不飽和脂肪酸逆轉肝癌MDR有待進一步研究。因此本研究設計DHA為代表的ω-3不飽和脂肪酸功能性納米載體，探究其協(xié)同阿霉素（doxorubicin，DOX）給藥對肝癌MDR的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器 人肝癌細胞HepG2和人肝癌耐藥細胞HepG2/ADM均購自上海雅吉生物科技有限公司；DHA和DOX均購自美國Sigma公司；葉酸聚乙二醇磷脂（DSPE-PEG2000-Folate）購自西安瑞禧生物科技有限公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術公司；大豆磷脂、BCA蛋白定量試劑盒、化學發(fā)光檢測試劑、預染蛋白marker均購自美國Solarbio公司；MDR相關蛋白（MRP）抗體購自美國Affinity Biosciences公司；肺耐藥相關蛋白（LRP）、乳腺癌抗藥性蛋白（BCRP）、凋亡相關蛋白（Bcl-2）抗體均購自上海Abcam公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液（DMEM）、胰蛋白酶溶液（0.25%）均購自美國Hyclone公司；FBS購自浙江天杭生物科技。Micro17R型低溫高速離心、BB150型細胞培養(yǎng)箱機均購自美國Thermo公司；Zeta PALS型粒度分析儀購自美國BIC公司；EPS300型電泳儀、VE180C型電泳槽和VE1816型轉膜儀購自上海天能公司；610020-9Q型化學發(fā)光儀購自上海勤翔公司；AE2000型倒置顯微鏡購自中國Motic公司；Axio Observer A1型倒置熒光顯微鏡購自德國ZEISS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HepG2、HepG2/ADM細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 載藥納米載體的構建及表征 采用高壓乳化的方法制備載藥納米載體，選取DHA、DOX為油相，大豆磷脂和DSPE-PEG2000-Folate為表面活性劑，甘油為助表面活性劑。將處方量的DHA、DOX和表面活性劑混合，加熱融解，2 000 r/min高速剪切，將油相滴入含助表面活性劑的水相中，剪切混勻，高壓乳勻機，800 bar的壓力，乳化8遍，即得，充氮密封保存。取所制的載藥納米載體溶于去離子水中，設置溶劑為水，用粒度分析儀測定平均粒徑為120 nm。

1.2.3 實驗分組 將兩種細胞分為HepG2/ADM組、HepG2+DOX組、HepG2+DOX納米粒組、HepG2/ADM+DOX組、HepG2/ADM+DOX納米粒組。HepG2+DOX組、HepG2/ADM+DOX組細胞培養(yǎng)時加入5 μg/ml DOX溶液，HepG2+DOX納米粒組和HepG2/ADM+DOX納米粒組細胞培養(yǎng)時加入5 μg/ml DOX納米載體（下述）。

1.2.4 細胞活性檢測 采用CCK-8法。選取對數(shù)生長期HepG2細胞以 1×105/ml，和 HepG2/ADM細胞以5×104/ml分別接種于 96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔。在 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入相應藥物，對照孔加相應體積的培養(yǎng)液，每組設5個平行孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加10 μl CCK-8溶液，再培養(yǎng)4 h，用酶聯(lián)免疫儀在波長450 nm處讀取吸光度（A）值，取平均值。按公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=[（實驗組（OD）-空白組（OD）]/（對照組（OD）-空白組（OD）]×100%。

1.2.5 載藥納米粒細胞攝取能力檢測 將HepG2和HepG2/ADM細胞以1×105/孔接種于共聚焦專用的四室小皿中，培養(yǎng)4～8 h后，分別加入5 μg/ml DOX溶液或5 μg/ml DOX 納米載體，37 ℃共孵育 2、8、24 h。棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，每孔用0.5 ml的4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，在倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)載藥納米粒的分布情況。

1.2.6 載藥納米粒的細胞內(nèi)DOX濃度測定 將HepG2和HepG2/ADM細胞接種于6個12孔板，每個時間點對應1個12孔板，每組設置3個平行孔；分別給予5 μg/ml DOX 溶液或 5 μg/ml DOX 納米載體，孵育 1、2、4、8、12、24 h后棄去細胞培養(yǎng)液，加入100 μl RIPA細胞裂解液，再加入900 μl PBS，反復凍融，離心后取上清液，采用分光光度法測定熒光值，計算DOX濃度。

1.2.7 MRP、LRP、BCRP、Bcl-2蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取對數(shù)生長期的HepG2和HepG2/ADM細胞制成1×108/ml單細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，5組細胞貼壁后分別加入相應藥物作用48 h后收集細胞，用PBS洗滌2次，加RIPA裂解液提取細胞總蛋白質(zhì)，用BCA法測蛋白濃度。分別取適量蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉搖床振蕩1.5～2 h，將膜放入含一抗稀釋液的孵育盒中，4℃搖床振蕩孵育過夜；TBST洗10 min×3次，加入用5%脫脂奶粉封閉液稀釋的二抗，室溫搖床振蕩反應1～2 h，TBST洗膜5 min×3次。在PVDF膜上滴加A、B兩種ECL發(fā)光試劑的混合液，充分接觸反應3 min。掃描條帶，采用chemi caPture軟件對結果進行拍攝。每組分別進行3次獨立的平行實驗。

1.2.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 5組細胞存活率比較 與HepG2/ADM組比較，HepG2+DOX組、HepG2+DOX納米粒組、HepG2/ADM+DOX組、HepG2/ADM+DOX納米粒組存活率均明顯為低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；與HepG2/ADM+DOX組比較，HepG2/ADM+DOX納米粒組存活率為低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 5組細胞存活率比較（%）

2.2 HepG2和HepG2/ADM細胞的藥物攝取能力 隨著藥物作用時間的延長，細胞熒光強度增加，藥物攝取能力增強。HepG2/ADM+DOX納米粒組藥物攝取能力最強，HepG2+DOX納米粒組次之，HepG2+DOX組最弱，見圖 1（插頁）。

圖1 HepG2和HepG2/ADM細胞的藥物攝取能力（DOX為阿霉素；×200）

2.3 載藥納米粒的細胞內(nèi)DOX濃度比較 隨著藥物作用時間的延長，HepG2與HepG2/ADM細胞內(nèi)DOX濃度均持續(xù)增長。HepG2+DOX納米粒組與HepG2+DOX組、HepG2/ADM+DOX納米粒組與HepG2/ADM+DOX組相比，細胞內(nèi)DOX濃度高且增長速率較快，但差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖2。

圖2 細胞內(nèi)DOX濃度變化曲線（DOX為阿霉素）

2.4 5 組細胞 MRP、LRP、BCRP、Bcl-2 蛋白表達水平比較 與HepG2/ADM組相比，HepG2+DOX組、HepG2+DOX納米粒組和HepG2/ADM+DOX納米粒組細胞中MRP、LRP、BCRP與Bcl-2蛋白表達水平均明顯為低（均 P＜0.05），見圖 3、表 2。

3 討論

圖3 5組MRP、LRP、BCRP與Bcl-2蛋白電泳圖（MRP為多藥耐藥相關蛋白；LRP為肺耐藥相關蛋白；BCRP為乳腺癌抗藥性蛋白；Bcl-2為凋亡相關蛋白；A：HepG2/ADM 組；B：HepG2+DOX 組；C：HepG2+DOX 納米粒組；D：HepG2/ADM+DOX 組；E：HepG2/ADM+DOX納米粒組；DOC為阿霉素）

DHA是人類大腦和視網(wǎng)膜組織中細胞膜的組成成分，也是胎兒出生后早期大腦和視力發(fā)展的重要組成部分[5]，近年來人們發(fā)現(xiàn)以DHA為代表的ω-3不飽和脂肪酸對惡性腫瘤的發(fā)生和轉歸具有突出的影響。Mahmoudi等[6]發(fā)現(xiàn)DHA可降低多能性網(wǎng)絡基因的高表達水平，并重新激活DNA錯配修復缺失/鼠類肉瘤病毒癌基因突變的結直腸癌干細胞樣細胞中的半胱氨酸蛋白酶-3和凋亡，表明了DHA在CRC治療中的應用潛力，其在協(xié)同藥物增強逆轉腫瘤耐藥功效方面具有一定作用。

腫瘤細胞的MDR是臨床用藥和新藥開發(fā)的主要障礙。尋找具有強抗MDR性的新化合物是克服腫瘤耐藥的有效途徑[7]。MDR的主要機制之一是膜三磷酸腺苷結合盒（ABC）轉運蛋白的過表達，例如P-糖蛋白（Pgp/ABCB1）、MDR 相關蛋白（MRP/ABCC）和乳腺癌抵抗蛋白（BCRP/ABCG2）[4，8-10]。其他與 MDR 有關的因素還有肺耐藥相關蛋白的高表達[11]、谷胱甘肽S轉移酶和谷胱甘肽的升高[12]、拓撲異構酶Ⅱ相關的DNA損傷修復增加、抑制藥物誘導的p53凋亡以及與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）相關的癌細胞生長的調(diào)控[13]。基于上述研究，本研究通過檢測MRP、LRP、BCRP、Bcl-2蛋白的表達水平來反映功能性納米載體藥物對肝癌細胞MDR的逆轉效果。Western blot結果表明，HepG2/ADM+DOX納米粒組細胞中ADM相關蛋白表達量總體呈現(xiàn)下降趨勢，且MRP與LRP蛋白的表達水平均顯著下降，這提示DOX納米?？梢韵抡{(diào)細胞ADM相關蛋白表達水平，以高效克服腫瘤MDR，進而使DOX可以充分揮發(fā)其抗腫瘤作用，增加MDR細胞的程序性死亡，提高抗腫瘤藥物的體內(nèi)療效。

表2 5組細胞MRP、LRP、BCRP、Bcl-2蛋白表達水平比較

MDR機制的復雜性決定了在逆轉MDR中應有協(xié)同用藥的理念。如Dong等[14]開發(fā)了核殼納米粒來同時包封紫杉醇和吉西他濱用于乳腺癌治療，與單獨的紫杉醇或相同濃度的單獨吉西他濱治療相比，兩藥的共同遞送系統(tǒng)呈現(xiàn)顯著的抗癌效果，同時體內(nèi)全身性毒性降低。Devalapally等[15]設計了一種共載外源性神經(jīng)酰胺和紫杉醇的聚環(huán)氧乙烷-聚ε-己內(nèi)酯聚合物膠束，用于治療耐紫杉醇的卵巢癌細胞株（SKOV-3TR），發(fā)現(xiàn)相比于單獨使用紫杉醇，聯(lián)合用藥療效增加100倍。本研究采用DOX和MDR逆轉劑共輸送以增強逆轉肝癌MDR，結果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥使MDR細胞對DOX的敏感性增加至非耐藥細胞的敏感性水平，藥物對細胞的增殖抑制作用也更加顯著。雖然化療藥和MDR逆轉劑的共輸送能夠在一定程度上增強逆轉MDR的作用，一般逆轉劑在應用時存在極大不良反應，損害患者生活質(zhì)量，限制了其臨床應用[16]。與一般逆轉劑不同，本研究設計的DHA納米載體是高安全性的功能性輔料，對開發(fā)高效低毒的功能性納米給藥系統(tǒng)具有重要意義。此外，納米技術可以通過改善化療藥物給藥途徑、拮抗和抵消腫瘤細胞主動外排藥物的作用從而提高了腫瘤細胞內(nèi)的藥物濃度，是DOX納米粒載體另一大優(yōu)勢。

綜上所述，基于ω-3不飽和脂肪酸的功能性納米載體的DOX可以在一定程度上逆轉肝癌MDR，其內(nèi)在機制可能是通過下調(diào)與ADM發(fā)生、發(fā)展相關的MRP與LRP蛋白的表達。該結果為進一步利用基于ω-3不飽和脂肪酸的功能性納米載體來逆轉肝癌MDR提供了理論依據(jù)，為開發(fā)了有效給藥系統(tǒng)提供新的思路。