方人馳 田學(xué)斌 陳櫟江 趙雅潔 鄭相闊 王沖 董郭楓 劉海洋 曹建明 周鐵麗

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，尤其是多重耐藥（multi-drug resistance，MDR）革蘭陰性桿菌的出現(xiàn)和廣泛流行，嚴(yán)重影響了抗菌藥物對重癥感染患者的有效治療。WHO在2017年發(fā)布的《全球抗菌藥物耐藥細(xì)菌優(yōu)先名單》中，將碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌及腸桿菌科細(xì)菌置于第一優(yōu)先級[1]。有限的藥物選擇使得“老藥”多黏菌素成為了治療MDR革蘭陰性桿菌引起感染的防線藥物之一[2]。隨著多黏菌素在臨床上使用逐漸增多，關(guān)于多黏菌素耐藥革蘭陰性菌的報道也在不斷增加[3-5]，因此對臨床分離菌株的多黏菌素敏感性檢測受到醫(yī)務(wù)工作者的高度重視。但由于多黏菌素在瓊脂中的擴(kuò)散能力不佳，使得E-test、紙片擴(kuò)散法等傳統(tǒng)抗菌藥敏試驗(yàn)表現(xiàn)出過高的假敏感率（高達(dá)32%）[6-7]。美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）推薦的參考方法微量肉湯稀釋法，因?qū)Σ僮饕筝^高而難以在臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛開展。近年Nordmann等[8]研發(fā)了一種快速多黏菌素NP法（rapid polymyxin NP test），該方法通過pH指示劑顏色變化檢測在多黏菌素存在下的細(xì)菌糖代謝，可在4 h內(nèi)檢測出腸桿菌科細(xì)菌是否對多黏菌素耐藥。但由于該方法的原理是基于檢測可視化的葡萄糖代謝，他們未考慮其在非發(fā)酵菌如鮑曼不動桿菌或銅綠假單胞菌中的應(yīng)用，因此本研究在評價快速多黏菌素NP法檢測腸桿菌科多黏菌素耐藥性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索改良該方法使其適用于多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌的檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2010年11月至2019年6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分離的多黏菌素E耐藥株共42株，其中腸桿菌科細(xì)菌34株（包含大腸埃希菌14株、肺炎克雷伯菌20株）、鮑曼不動桿菌8株；隨機(jī)選取同期多黏菌素E敏感株120株，其中腸桿菌科細(xì)菌100株（大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌各50株）、鮑曼不動桿菌20株。排除分離自同一患者同一部位的重復(fù)菌株，所有菌株均經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定系統(tǒng)鑒定，采用微量肉湯稀釋法測定多黏菌素E的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。臨床分離菌株接種于含30%甘油（規(guī)格500 ml/瓶，批號：190105，西隴科學(xué)股份有限公司）的Luria Bertani（LB）肉湯保菌管中，并置于-80℃冰箱（超低溫保存箱DW-86L828，青島海爾股份有限公司）中保存?zhèn)溆?。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922與銅綠假單胞菌ATCC 27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器和試劑 MALDI-TOF-MS（VITEK MS）購自法國生物梅里埃公司；微量移液器購自德國Eppendorf公司；Mueller-Hinton（MH）肉湯（規(guī)格 500 g/瓶，批號1737584）購自英國 OXOID 公司；D-（+）-葡萄糖（規(guī)格500 g，批號：E914BA0014）購自上海生工有限公司；酚紅（規(guī)格 5 g/瓶，批號：MKCC3312）購自美國 Sigma-alorich公司；多黏菌素 E（規(guī)格 200 mg/管，A-20180326-1833）購自溫州康泰生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥物敏感性試驗(yàn) 多黏菌素E對共162株試驗(yàn)菌株的MIC值測定采用微量肉湯稀釋法，具體操作參照CLSI指南[9]執(zhí)行，取臨床分離菌株與質(zhì)控菌株接種于哥倫比亞血平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取平板表面單菌落在0.85%氯化鈉溶液中調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，使用陽離子校正的MH肉湯（CAMHB）菌懸液稀釋100倍待用。在96孔板相應(yīng)孔中加入100 μl CAMHB，配制多黏菌素 E 母液，選擇合適的濃度梯度（0.06～64 μg/ml）在 96孔板中進(jìn)行倍比稀釋，隨后在相應(yīng)孔中加入100 μl菌懸液，同時進(jìn)行陰性對照，37℃培養(yǎng)16～18 h后讀取MIC值。根據(jù) CLSI指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)[10]，當(dāng) MIC≤2 μg/ml時即為敏感，MIC≥4 μg/ml時即為耐藥。大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)所使用的質(zhì)控菌株為ATCC 25922，鮑曼不動桿菌藥敏試驗(yàn)所使用的質(zhì)控菌株為ATCC 27853，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作3次，取至少兩次實(shí)驗(yàn)中數(shù)值相同的MIC值作為結(jié)果，以保證結(jié)果準(zhǔn)確。

1.4 快速多黏菌素NP法 基于Nordmann等[8]提供的規(guī)程，首先配制快速多黏菌素NP法試劑，以配制250 ml為例，稱取6.25 g陽離子校正的MH粉末、0.012 5 g酚紅，溶于225 ml蒸餾水，然后使用1 mol/L HCL將溶液pH調(diào)至6.7，并在121℃下高壓滅菌15 min。待冷卻至室溫后，加入25 ml過濾滅菌的10%D-（+）-葡萄糖，使溶液中葡萄糖濃度為1%，該試劑可在4℃下儲存1周或在-20℃下儲存1年。在實(shí)驗(yàn)操作之前，應(yīng)將快速多黏菌素NP試劑在37℃中預(yù)熱，配制0.2 mg/ml多黏菌素E母液，取適量試劑加入多黏菌素E母液使之達(dá)到5 μg/ml的濃度（每1 ml試劑中加入25 μl多黏菌素E母液）。試驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行，使用微量加樣槍將不含多黏菌素E的快速多黏菌素試劑與含5 μg/ml多黏菌素E的快速多黏菌素試劑轉(zhuǎn)入兩排平行孔中，每孔加入150 μl。將臨床分離菌株接種于哥倫比亞血平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取平板表面單菌落在0.85%氯化鈉溶液中調(diào)至 3.0～3.5 麥?zhǔn)蠞岫龋s 1×109CFU/ml），將菌懸液加入到含有及不含多黏菌素E的平行孔中，每孔加入50 μl，取等量無菌0.85%氯化鈉溶液加入一組孔中作為空白對照。最終每孔中菌懸液濃度達(dá)到2.5×108CFU/ml左右，多黏菌素E濃度為3.75 μg/ml。本試驗(yàn)陰性質(zhì)控選擇大腸埃希菌ATCC 25922，陽性質(zhì)控選擇臨床分離的摩根摩根菌（對多黏菌素天然耐藥）。

為探索快速多黏菌素NP法在鮑曼不動桿菌中的應(yīng)用，在配制含1%D-（+）-葡萄糖的快速多黏菌素NP試劑基礎(chǔ)上，另行配制含2%、4%D-（+）-葡萄糖的快速多黏菌素NP試劑，進(jìn)行平行試驗(yàn)。

1.5 快速多黏菌素NP法結(jié)果判讀 將加樣完成后的96孔板置于37℃，無震蕩，培養(yǎng)4 h（在檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素E耐藥性時延長培養(yǎng)時間至24 h）。根據(jù)Nordmann等[8]所描述的判定方法，在培養(yǎng)時間內(nèi)，每小時觀察并記錄一次結(jié)果，當(dāng)pH指示劑（酚紅）由初始的橙色完全變?yōu)辄S色時，可證實(shí)腸桿菌科細(xì)菌在孔中發(fā)生了葡萄糖代謝并產(chǎn)生弱酸，從而導(dǎo)致pH的下降引起酚紅的變色。在觀察過程內(nèi)，臨床分離菌株所在的含多黏菌素E與不含多黏菌素E的孔中均發(fā)生由橙色到黃色的變色反應(yīng)，則判定為多黏菌素E耐藥（陽性結(jié)果），若僅在不含多黏菌素E的孔中發(fā)生變色，含多黏菌素E的孔未變色或不完全變色，則判定為多黏菌素E敏感（陰性結(jié)果）（圖1，插頁）。為排除其他因素導(dǎo)致試劑pH改變而引發(fā)結(jié)果誤讀，在培育10 min后觀察96孔板中所有孔的顏色是否變化，保持橙色為正常。當(dāng)空白對照孔保持橙色且陽性對照與陰性對照顯示正確結(jié)果時，認(rèn)為本次試驗(yàn)結(jié)果在控。所有快速多黏菌素NP法結(jié)果均由兩名技術(shù)人員獨(dú)立判斷，僅在判斷一致情況下，可認(rèn)為讀取結(jié)果可靠。

圖1 快速多黏菌素NP法結(jié)果示例[第1列孔為空白對照結(jié)果（使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的氯化鈉替代菌懸液）；第2列孔為多黏菌素E耐藥株結(jié)果；第3列孔為多黏菌素E敏感株的結(jié)果。每株分離株的細(xì)菌懸液加入到無多黏菌素E（上排）以及含多黏菌素E（下排）的兩個平行孔中]

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 為評估快速多黏菌素NP法的性能，以微量肉湯稀釋法結(jié)果為參考，計(jì)算快速多黏菌素NP法的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率。其中準(zhǔn)確率定義為兩種診斷方法結(jié)果一致的測試數(shù)與被測總數(shù)的比率。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離菌株的多黏菌素E藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)14株多黏菌素E耐藥大腸埃希菌的MIC值在4～16 μg/ml，20株多黏菌素E耐藥肺炎克雷伯菌的MIC值≥8 μg/ml，8株多黏菌素E耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值在4～16 μg/ml，120株多黏菌素E敏感臨床分離菌株的 MIC 值≤2 μg/ml。

2.2 腸桿菌科細(xì)菌的快速多黏菌素NP法結(jié)果 根據(jù)每小時記錄的結(jié)果顯示，所有多黏菌素E耐藥的大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌均顯示快速多黏菌素NP法陽性，絕大多數(shù)多黏菌素E敏感菌株顯示快速多黏菌素NP法陰性，僅1株多黏菌素E敏感大腸埃希菌顯示陽性結(jié)果，該菌株MIC值為2 μg/ml（表1）。以微量肉湯稀釋法結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，快速多黏菌素NP法檢測腸桿菌科多黏菌素E耐藥性的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率分別為100%（34/34）、99%（99/100）和 99.3%（133/134）。所有菌株的變色反應(yīng)均在2 h內(nèi)完成，且實(shí)驗(yàn)過程中未發(fā)現(xiàn)變色不完全現(xiàn)象。

表1 大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌快速多黏菌素NP法結(jié)果與微量肉湯稀釋法結(jié)果比較

2.3 鮑曼不動桿菌的快速多黏菌素NP法結(jié)果 根據(jù)每小時記錄的結(jié)果顯示，在含1%、2%、4%葡萄糖的平行組中，加入鮑曼不動桿菌的孔在4 h內(nèi)均未發(fā)生變色或發(fā)生不完全變色，但延長培養(yǎng)時間后，逐漸出現(xiàn)由橙色轉(zhuǎn)為黃色的完全變色反應(yīng)。當(dāng)快速多黏菌素NP法結(jié)果與MIC值相對應(yīng)認(rèn)為是正確檢測結(jié)果，出現(xiàn)其他情況如不完全變色、非正常變色反應(yīng)等認(rèn)為結(jié)果不正確，計(jì)算每小時快速多黏菌素NP法檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素E耐藥性的準(zhǔn)確率，結(jié)果顯示：不同葡萄糖濃度的3組平行試驗(yàn)的準(zhǔn)確率均隨時間不斷提高，直至15 h左右。隨著培養(yǎng)時間進(jìn)一步延長，1%葡萄糖組中的一些孔出現(xiàn)非正常變色（由黃色轉(zhuǎn)為紅色），導(dǎo)致準(zhǔn)確率發(fā)生下降，2%葡萄糖組與4%葡萄糖組在16～24 h內(nèi)保持較高且穩(wěn)定的準(zhǔn)確率，尤其是4%葡萄糖組（圖2）。在培養(yǎng)時間達(dá)到16 h后，4%葡萄糖組所有多黏菌素E耐藥鮑曼不動桿菌均顯示陽性，除2株多黏菌素E敏感鮑曼不動桿菌出現(xiàn)假陽性結(jié)果外，其余敏感菌株結(jié)果均為陰性（表2）。以微量肉湯稀釋法結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，4%葡萄糖組快速多黏菌素NP法檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素E耐藥性的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率為100%（8/8）、90%（18/20）和 92.9%（26/28）。

圖2 隨時間的變化應(yīng)用于鮑曼不動桿菌的快速多黏菌素NP法的準(zhǔn)確率

表2 鮑曼不動桿菌快速多黏菌素NP法結(jié)果與微量肉湯稀釋法結(jié)果比較

3 討論

快速多黏菌素NP法是一種用于檢測腸桿菌科細(xì)菌多黏菌素耐藥性的快速篩查試驗(yàn)。該試驗(yàn)可通過pH指示劑顏色變化來檢測在多黏菌素如多黏菌素B或多黏菌素E存在下細(xì)菌是否生長并代謝葡萄糖產(chǎn)酸。如Nordmann等[8]所描述的，該方法檢測腸桿菌科多黏菌素耐藥性的靈敏度和特異度達(dá)到了99.3%和95.4%，為快速、準(zhǔn)確、高效地檢測腸桿菌科多黏菌素耐藥性提供了可能性。此外，來自印度和泰國的研究者在使用當(dāng)?shù)氐亩囵ぞ啬退幠c桿菌科細(xì)菌對快速多黏菌素NP法進(jìn)行評估后，表達(dá)了對該方法檢測性能的認(rèn)同[11-12]。在本研究中，快速多黏菌素NP法在腸桿菌科臨床分離菌株中靈敏度和特異度分別高達(dá)100%與99%，可滿足臨床對快速檢測多黏菌素耐藥性的需求。

由于鮑曼不動桿菌具備多種逃避抗菌藥物的機(jī)制，同時MDR鮑曼不動桿菌的流行趨勢也十分嚴(yán)峻[13]，臨床實(shí)驗(yàn)室亟需對鮑曼不動桿菌的多黏菌素耐藥性進(jìn)行有效的監(jiān)測。因此，本研究初步探索了快速多黏菌素NP法應(yīng)用于鮑曼不動桿菌的可行性，結(jié)果顯示在提高快速多黏菌素NP試劑中的葡萄糖濃度并延長培養(yǎng)時間后，可獲得較高的準(zhǔn)確率（92.9%）。經(jīng)分析，鮑曼不動桿菌變色反應(yīng)時間延長可能主要?dú)w因于代謝途徑，與腸桿菌科細(xì)菌相比，非發(fā)酵菌利用葡萄糖形成酸性代謝物的能力較弱，且分解氮源產(chǎn)生的堿性物質(zhì)可與酸性物質(zhì)發(fā)生中和反應(yīng)[14]。此外，1%葡萄糖組在15 h后出現(xiàn)非正常變色（黃色轉(zhuǎn)為紅色）導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確率下降可能是由于葡萄糖被耗盡，氮源持續(xù)分解產(chǎn)堿使pH值上升而由黃色轉(zhuǎn)為紅色（pH＞8.4）。當(dāng)葡萄糖充足時，如葡萄糖濃度達(dá)到4%，即可保持結(jié)果穩(wěn)定至24 h以上。盡管快速多黏菌素NP法應(yīng)用于鮑曼不動桿菌時需要在16 h后才可獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，但其靈敏度與特異度達(dá)到了100%與90%，可以滿足臨床檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素耐藥性的需求。

進(jìn)一步的耐藥機(jī)制研究結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)菌株中14株大腸埃希菌對多黏菌素E的耐藥性與攜帶mcr-1基因相關(guān)（部分耐藥機(jī)制已發(fā)表[15]），14株肺炎克雷伯菌對多黏菌素E的耐藥性與染色體基因mgrB和phoQ突變相關(guān)（6株未研究），8株鮑曼不動桿菌對多黏菌素E的耐藥性主要與lpxA、lpxC、lpxD和pmrB等染色體基因突變或AdeABC/AdeIJK外排泵表達(dá)量上升相關(guān)。這表明，快速多黏菌素NP法除了具備快速、靈敏、特異、成本低廉和操作簡便的優(yōu)勢以外，還具有檢測性能不受多黏菌素耐藥機(jī)制影響的特點(diǎn)。因此，該方法可以作為多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌及鮑曼不動桿菌的初步篩查手段。然而，該方法還存在一定的局限性。Nordmann等[8]指出由于該方法通過對從橙色到黃色的顏色改變判讀結(jié)果，所以在解釋低水平耐藥菌株的結(jié)果時應(yīng)當(dāng)更加謹(jǐn)慎。在本研究中有一株多黏菌素E敏感（MIC為2 μg/ml）大腸埃希菌的快速多黏菌素NP法結(jié)果為陽性，表明快速多黏菌素NP法在檢測臨近耐藥折點(diǎn)（MIC為4 μg/ml）的菌株時準(zhǔn)確率可能會降低。此外，Simar等[16]的研究發(fā)現(xiàn)快速多黏菌素NP法檢測陰溝腸桿菌與產(chǎn)氣腸桿菌多黏菌素耐藥性的靈敏度僅為25%，因此筆者認(rèn)為該方法在檢測腸桿菌屬細(xì)菌的多黏菌素E耐藥性時可能存在局限，需要更大規(guī)模的評估，但在其他多個關(guān)于快速多黏菌素NP法的研究中也對腸桿菌屬細(xì)菌同時進(jìn)行了評估，且結(jié)果的準(zhǔn)確率均表現(xiàn)良好[11-12，17-19]。因此仍需要更多的實(shí)驗(yàn)菌株以驗(yàn)證不同種類臨床分離菌株的快速多黏菌素NP法準(zhǔn)確率之間是否存在差異。

綜上所述，快速多黏菌素NP法具有快速、方便、靈敏、特異等優(yōu)勢，在檢測多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌方面具有較高的臨床應(yīng)用價值，且經(jīng)改良后在鮑曼不動桿菌多黏菌素耐藥性檢測中也具有一定的應(yīng)用價值，可幫助臨床篩查多黏菌素耐藥腸桿菌科細(xì)菌及鮑曼不動桿菌，為給予患者正確的藥物治療提供參考。