方人馳 田學斌 陳櫟江 趙雅潔 鄭相闊 王沖 董郭楓 劉海洋 曹建明 周鐵麗

細菌耐藥性的產生，尤其是多重耐藥（multi-drug resistance，MDR）革蘭陰性桿菌的出現(xiàn)和廣泛流行，嚴重影響了抗菌藥物對重癥感染患者的有效治療。WHO在2017年發(fā)布的《全球抗菌藥物耐藥細菌優(yōu)先名單》中，將碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌及腸桿菌科細菌置于第一優(yōu)先級[1]。有限的藥物選擇使得“老藥”多黏菌素成為了治療MDR革蘭陰性桿菌引起感染的防線藥物之一[2]。隨著多黏菌素在臨床上使用逐漸增多，關于多黏菌素耐藥革蘭陰性菌的報道也在不斷增加[3-5]，因此對臨床分離菌株的多黏菌素敏感性檢測受到醫(yī)務工作者的高度重視。但由于多黏菌素在瓊脂中的擴散能力不佳，使得E-test、紙片擴散法等傳統(tǒng)抗菌藥敏試驗表現(xiàn)出過高的假敏感率（高達32%）[6-7]。美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）推薦的參考方法微量肉湯稀釋法，因對操作要求較高而難以在臨床實驗室中廣泛開展。近年Nordmann等[8]研發(fā)了一種快速多黏菌素NP法（rapid polymyxin NP test），該方法通過pH指示劑顏色變化檢測在多黏菌素存在下的細菌糖代謝，可在4 h內檢測出腸桿菌科細菌是否對多黏菌素耐藥。但由于該方法的原理是基于檢測可視化的葡萄糖代謝，他們未考慮其在非發(fā)酵菌如鮑曼不動桿菌或銅綠假單胞菌中的應用，因此本研究在評價快速多黏菌素NP法檢測腸桿菌科多黏菌素耐藥性的基礎上，進一步探索改良該方法使其適用于多黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌的檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2010年11月至2019年6月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床分離的多黏菌素E耐藥株共42株，其中腸桿菌科細菌34株（包含大腸埃希菌14株、肺炎克雷伯菌20株）、鮑曼不動桿菌8株；隨機選取同期多黏菌素E敏感株120株，其中腸桿菌科細菌100株（大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌各50株）、鮑曼不動桿菌20株。排除分離自同一患者同一部位的重復菌株，所有菌株均經基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）鑒定系統(tǒng)鑒定，采用微量肉湯稀釋法測定多黏菌素E的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。臨床分離菌株接種于含30%甘油（規(guī)格500 ml/瓶，批號：190105，西隴科學股份有限公司）的Luria Bertani（LB）肉湯保菌管中，并置于-80℃冰箱（超低溫保存箱DW-86L828，青島海爾股份有限公司）中保存?zhèn)溆?。質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922與銅綠假單胞菌ATCC 27853購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器和試劑 MALDI-TOF-MS（VITEK MS）購自法國生物梅里埃公司；微量移液器購自德國Eppendorf公司；Mueller-Hinton（MH）肉湯（規(guī)格 500 g/瓶，批號1737584）購自英國 OXOID 公司；D-（+）-葡萄糖（規(guī)格500 g，批號：E914BA0014）購自上海生工有限公司；酚紅（規(guī)格 5 g/瓶，批號：MKCC3312）購自美國 Sigma-alorich公司；多黏菌素 E（規(guī)格 200 mg/管，A-20180326-1833）購自溫州康泰生物技術有限公司。

1.3 藥物敏感性試驗 多黏菌素E對共162株試驗菌株的MIC值測定采用微量肉湯稀釋法，具體操作參照CLSI指南[9]執(zhí)行，取臨床分離菌株與質控菌株接種于哥倫比亞血平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取平板表面單菌落在0.85%氯化鈉溶液中調至0.5麥氏濁度，使用陽離子校正的MH肉湯（CAMHB）菌懸液稀釋100倍待用。在96孔板相應孔中加入100 μl CAMHB，配制多黏菌素 E 母液，選擇合適的濃度梯度（0.06～64 μg/ml）在 96孔板中進行倍比稀釋，隨后在相應孔中加入100 μl菌懸液，同時進行陰性對照，37℃培養(yǎng)16～18 h后讀取MIC值。根據(jù) CLSI指南推薦的標準[10]，當 MIC≤2 μg/ml時即為敏感，MIC≥4 μg/ml時即為耐藥。大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌藥敏試驗所使用的質控菌株為ATCC 25922，鮑曼不動桿菌藥敏試驗所使用的質控菌株為ATCC 27853，實驗獨立重復操作3次，取至少兩次實驗中數(shù)值相同的MIC值作為結果，以保證結果準確。

1.4 快速多黏菌素NP法 基于Nordmann等[8]提供的規(guī)程，首先配制快速多黏菌素NP法試劑，以配制250 ml為例，稱取6.25 g陽離子校正的MH粉末、0.012 5 g酚紅，溶于225 ml蒸餾水，然后使用1 mol/L HCL將溶液pH調至6.7，并在121℃下高壓滅菌15 min。待冷卻至室溫后，加入25 ml過濾滅菌的10%D-（+）-葡萄糖，使溶液中葡萄糖濃度為1%，該試劑可在4℃下儲存1周或在-20℃下儲存1年。在實驗操作之前，應將快速多黏菌素NP試劑在37℃中預熱，配制0.2 mg/ml多黏菌素E母液，取適量試劑加入多黏菌素E母液使之達到5 μg/ml的濃度（每1 ml試劑中加入25 μl多黏菌素E母液）。試驗在96孔板中進行，使用微量加樣槍將不含多黏菌素E的快速多黏菌素試劑與含5 μg/ml多黏菌素E的快速多黏菌素試劑轉入兩排平行孔中，每孔加入150 μl。將臨床分離菌株接種于哥倫比亞血平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取平板表面單菌落在0.85%氯化鈉溶液中調至 3.0～3.5 麥氏濁度（約 1×109CFU/ml），將菌懸液加入到含有及不含多黏菌素E的平行孔中，每孔加入50 μl，取等量無菌0.85%氯化鈉溶液加入一組孔中作為空白對照。最終每孔中菌懸液濃度達到2.5×108CFU/ml左右，多黏菌素E濃度為3.75 μg/ml。本試驗陰性質控選擇大腸埃希菌ATCC 25922，陽性質控選擇臨床分離的摩根摩根菌（對多黏菌素天然耐藥）。

為探索快速多黏菌素NP法在鮑曼不動桿菌中的應用，在配制含1%D-（+）-葡萄糖的快速多黏菌素NP試劑基礎上，另行配制含2%、4%D-（+）-葡萄糖的快速多黏菌素NP試劑，進行平行試驗。

1.5 快速多黏菌素NP法結果判讀 將加樣完成后的96孔板置于37℃，無震蕩，培養(yǎng)4 h（在檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素E耐藥性時延長培養(yǎng)時間至24 h）。根據(jù)Nordmann等[8]所描述的判定方法，在培養(yǎng)時間內，每小時觀察并記錄一次結果，當pH指示劑（酚紅）由初始的橙色完全變?yōu)辄S色時，可證實腸桿菌科細菌在孔中發(fā)生了葡萄糖代謝并產生弱酸，從而導致pH的下降引起酚紅的變色。在觀察過程內，臨床分離菌株所在的含多黏菌素E與不含多黏菌素E的孔中均發(fā)生由橙色到黃色的變色反應，則判定為多黏菌素E耐藥（陽性結果），若僅在不含多黏菌素E的孔中發(fā)生變色，含多黏菌素E的孔未變色或不完全變色，則判定為多黏菌素E敏感（陰性結果）（圖1，插頁）。為排除其他因素導致試劑pH改變而引發(fā)結果誤讀，在培育10 min后觀察96孔板中所有孔的顏色是否變化，保持橙色為正常。當空白對照孔保持橙色且陽性對照與陰性對照顯示正確結果時，認為本次試驗結果在控。所有快速多黏菌素NP法結果均由兩名技術人員獨立判斷，僅在判斷一致情況下，可認為讀取結果可靠。

圖1 快速多黏菌素NP法結果示例[第1列孔為空白對照結果（使用質量分數(shù)為0.85%的氯化鈉替代菌懸液）；第2列孔為多黏菌素E耐藥株結果；第3列孔為多黏菌素E敏感株的結果。每株分離株的細菌懸液加入到無多黏菌素E（上排）以及含多黏菌素E（下排）的兩個平行孔中]

1.6 統(tǒng)計學處理 為評估快速多黏菌素NP法的性能，以微量肉湯稀釋法結果為參考，計算快速多黏菌素NP法的靈敏度、特異度和準確率。其中準確率定義為兩種診斷方法結果一致的測試數(shù)與被測總數(shù)的比率。

2 結果

2.1 臨床分離菌株的多黏菌素E藥敏試驗結果 結果發(fā)現(xiàn)14株多黏菌素E耐藥大腸埃希菌的MIC值在4～16 μg/ml，20株多黏菌素E耐藥肺炎克雷伯菌的MIC值≥8 μg/ml，8株多黏菌素E耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值在4～16 μg/ml，120株多黏菌素E敏感臨床分離菌株的 MIC 值≤2 μg/ml。

2.2 腸桿菌科細菌的快速多黏菌素NP法結果 根據(jù)每小時記錄的結果顯示，所有多黏菌素E耐藥的大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌均顯示快速多黏菌素NP法陽性，絕大多數(shù)多黏菌素E敏感菌株顯示快速多黏菌素NP法陰性，僅1株多黏菌素E敏感大腸埃希菌顯示陽性結果，該菌株MIC值為2 μg/ml（表1）。以微量肉湯稀釋法結果為標準，快速多黏菌素NP法檢測腸桿菌科多黏菌素E耐藥性的靈敏度、特異度和準確率分別為100%（34/34）、99%（99/100）和 99.3%（133/134）。所有菌株的變色反應均在2 h內完成，且實驗過程中未發(fā)現(xiàn)變色不完全現(xiàn)象。

表1 大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌快速多黏菌素NP法結果與微量肉湯稀釋法結果比較

2.3 鮑曼不動桿菌的快速多黏菌素NP法結果 根據(jù)每小時記錄的結果顯示，在含1%、2%、4%葡萄糖的平行組中，加入鮑曼不動桿菌的孔在4 h內均未發(fā)生變色或發(fā)生不完全變色，但延長培養(yǎng)時間后，逐漸出現(xiàn)由橙色轉為黃色的完全變色反應。當快速多黏菌素NP法結果與MIC值相對應認為是正確檢測結果，出現(xiàn)其他情況如不完全變色、非正常變色反應等認為結果不正確，計算每小時快速多黏菌素NP法檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素E耐藥性的準確率，結果顯示：不同葡萄糖濃度的3組平行試驗的準確率均隨時間不斷提高，直至15 h左右。隨著培養(yǎng)時間進一步延長，1%葡萄糖組中的一些孔出現(xiàn)非正常變色（由黃色轉為紅色），導致準確率發(fā)生下降，2%葡萄糖組與4%葡萄糖組在16～24 h內保持較高且穩(wěn)定的準確率，尤其是4%葡萄糖組（圖2）。在培養(yǎng)時間達到16 h后，4%葡萄糖組所有多黏菌素E耐藥鮑曼不動桿菌均顯示陽性，除2株多黏菌素E敏感鮑曼不動桿菌出現(xiàn)假陽性結果外，其余敏感菌株結果均為陰性（表2）。以微量肉湯稀釋法結果為標準，4%葡萄糖組快速多黏菌素NP法檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素E耐藥性的靈敏度、特異度和準確率為100%（8/8）、90%（18/20）和 92.9%（26/28）。

圖2 隨時間的變化應用于鮑曼不動桿菌的快速多黏菌素NP法的準確率

表2 鮑曼不動桿菌快速多黏菌素NP法結果與微量肉湯稀釋法結果比較

3 討論

快速多黏菌素NP法是一種用于檢測腸桿菌科細菌多黏菌素耐藥性的快速篩查試驗。該試驗可通過pH指示劑顏色變化來檢測在多黏菌素如多黏菌素B或多黏菌素E存在下細菌是否生長并代謝葡萄糖產酸。如Nordmann等[8]所描述的，該方法檢測腸桿菌科多黏菌素耐藥性的靈敏度和特異度達到了99.3%和95.4%，為快速、準確、高效地檢測腸桿菌科多黏菌素耐藥性提供了可能性。此外，來自印度和泰國的研究者在使用當?shù)氐亩囵ぞ啬退幠c桿菌科細菌對快速多黏菌素NP法進行評估后，表達了對該方法檢測性能的認同[11-12]。在本研究中，快速多黏菌素NP法在腸桿菌科臨床分離菌株中靈敏度和特異度分別高達100%與99%，可滿足臨床對快速檢測多黏菌素耐藥性的需求。

由于鮑曼不動桿菌具備多種逃避抗菌藥物的機制，同時MDR鮑曼不動桿菌的流行趨勢也十分嚴峻[13]，臨床實驗室亟需對鮑曼不動桿菌的多黏菌素耐藥性進行有效的監(jiān)測。因此，本研究初步探索了快速多黏菌素NP法應用于鮑曼不動桿菌的可行性，結果顯示在提高快速多黏菌素NP試劑中的葡萄糖濃度并延長培養(yǎng)時間后，可獲得較高的準確率（92.9%）。經分析，鮑曼不動桿菌變色反應時間延長可能主要歸因于代謝途徑，與腸桿菌科細菌相比，非發(fā)酵菌利用葡萄糖形成酸性代謝物的能力較弱，且分解氮源產生的堿性物質可與酸性物質發(fā)生中和反應[14]。此外，1%葡萄糖組在15 h后出現(xiàn)非正常變色（黃色轉為紅色）導致結果準確率下降可能是由于葡萄糖被耗盡，氮源持續(xù)分解產堿使pH值上升而由黃色轉為紅色（pH＞8.4）。當葡萄糖充足時，如葡萄糖濃度達到4%，即可保持結果穩(wěn)定至24 h以上。盡管快速多黏菌素NP法應用于鮑曼不動桿菌時需要在16 h后才可獲得穩(wěn)定可靠的結果，但其靈敏度與特異度達到了100%與90%，可以滿足臨床檢測鮑曼不動桿菌多黏菌素耐藥性的需求。

進一步的耐藥機制研究結果顯示，在實驗菌株中14株大腸埃希菌對多黏菌素E的耐藥性與攜帶mcr-1基因相關（部分耐藥機制已發(fā)表[15]），14株肺炎克雷伯菌對多黏菌素E的耐藥性與染色體基因mgrB和phoQ突變相關（6株未研究），8株鮑曼不動桿菌對多黏菌素E的耐藥性主要與lpxA、lpxC、lpxD和pmrB等染色體基因突變或AdeABC/AdeIJK外排泵表達量上升相關。這表明，快速多黏菌素NP法除了具備快速、靈敏、特異、成本低廉和操作簡便的優(yōu)勢以外，還具有檢測性能不受多黏菌素耐藥機制影響的特點。因此，該方法可以作為多黏菌素耐藥腸桿菌科細菌及鮑曼不動桿菌的初步篩查手段。然而，該方法還存在一定的局限性。Nordmann等[8]指出由于該方法通過對從橙色到黃色的顏色改變判讀結果，所以在解釋低水平耐藥菌株的結果時應當更加謹慎。在本研究中有一株多黏菌素E敏感（MIC為2 μg/ml）大腸埃希菌的快速多黏菌素NP法結果為陽性，表明快速多黏菌素NP法在檢測臨近耐藥折點（MIC為4 μg/ml）的菌株時準確率可能會降低。此外，Simar等[16]的研究發(fā)現(xiàn)快速多黏菌素NP法檢測陰溝腸桿菌與產氣腸桿菌多黏菌素耐藥性的靈敏度僅為25%，因此筆者認為該方法在檢測腸桿菌屬細菌的多黏菌素E耐藥性時可能存在局限，需要更大規(guī)模的評估，但在其他多個關于快速多黏菌素NP法的研究中也對腸桿菌屬細菌同時進行了評估，且結果的準確率均表現(xiàn)良好[11-12，17-19]。因此仍需要更多的實驗菌株以驗證不同種類臨床分離菌株的快速多黏菌素NP法準確率之間是否存在差異。

綜上所述，快速多黏菌素NP法具有快速、方便、靈敏、特異等優(yōu)勢，在檢測多黏菌素耐藥腸桿菌科細菌方面具有較高的臨床應用價值，且經改良后在鮑曼不動桿菌多黏菌素耐藥性檢測中也具有一定的應用價值，可幫助臨床篩查多黏菌素耐藥腸桿菌科細菌及鮑曼不動桿菌，為給予患者正確的藥物治療提供參考。