徐志紅， 鄧瑩

(1.德陽市人民醫(yī)院 生殖遺傳科， 四川 德陽 618000； 2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 中國出生缺陷監(jiān)測中心， 四川 成都 610041)

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌高發(fā)年齡為45～55歲，其病理類型主要分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌及腺鱗癌，其中以鱗狀細(xì)胞癌為最常見[1]。有研究顯示，子宮頸癌發(fā)病率和病死率位居我國女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌，發(fā)病率和病死率逐年上升并呈年輕化趨勢[1-2]。子宮頸癌發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)涉及多因素、多基因及多階段的復(fù)雜過程，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染已被證實(shí)是子宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的主要因素，子宮頸癌患者HPV感染率可高達(dá)90%[2]。除此之外，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谧訉m頸癌發(fā)病過程中也具有重要作用[3]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要分支，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、DNA構(gòu)象及穩(wěn)定性改變，在基因表達(dá)調(diào)控、基因組印跡及發(fā)育調(diào)節(jié)等方面起到重要作用[4]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secretory curl associated protein，SFRP)是細(xì)胞外因子(extracellular factor ，Wnt)信號(hào)通路的拮抗因子，可通過半胱氨酸富集區(qū)域(cysteine-rich domian，CRD)與Wnt配體結(jié)合而阻斷Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤增殖[5]。有研究顯示SFRP基因甲基化與乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤相關(guān)[6]，但其與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)性尚不清楚。因此本研究就子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與其臨床病理特征及HPV感染的關(guān)系進(jìn)行探討，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院倫理會(huì)審查批準(zhǔn)，選擇2018年8月—2019年8月收治的87例子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，收集其術(shù)中切除的癌組織及配對(duì)癌旁正常組織?；颊吣挲g25～70歲、中位年齡50歲，<50歲59例、≥50歲28例，腫瘤直徑<4 cm 58例、≥4 cm 29例；FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期73例、Ⅲ～Ⅳ期14例，WHO病理分級(jí)G1級(jí)37例、G2級(jí)29例、G3級(jí)21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌經(jīng)病理學(xué)檢查確診[1]；(2)未合并其他惡性腫瘤；(3)入院資料詳細(xì)；(4)入院前未接受任何抗癌治療；(5)所有研究對(duì)象及其家屬同意入組該實(shí)驗(yàn)，并獲得書面知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并凝血系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、傳染性疾病、精神系統(tǒng)疾病、感染性疾??；(2)合并心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器功能障礙；(3)妊娠或哺乳期女性；(4)依從性差；(5)合并轉(zhuǎn)移性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1SFRP基因甲基化檢測 采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)法，收集子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)中切除的癌組織及配對(duì)癌旁正常組織，采用組織基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)提取DNA，采用DNA甲基化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)進(jìn)行DNA變性及亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。以轉(zhuǎn)化后的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)SFRP基因甲基化特異引物和非甲基化特異引物，甲基化特異引物上游為5′-GGTATATTTTCGAGGGGTACG-3′，下游為5′-TTCCCGACCCGCACTCCGC-3′；SFRP基因非甲基化特異引物上游為5′-TGTGAGGGTATATTTTTGAGGGGTAT-3′，下游為5′-CTTCTCTCTCCACTTCCCAACCCA-3′。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，5×PCR緩沖液10 μL，上下游引物各0.5 μL，加無核酶水補(bǔ)充至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性120 s，95 ℃變性60 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s，40次循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)攝像分析，如基因甲基化特異引物擴(kuò)增出目的條帶則提示SFRP基因甲基化陽性，計(jì)算SFRP基因甲基化率。

1.2.2HPV感染檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，q-PCR)法，采用無菌棉簽采集子宮頸拭子，洗滌到含1 mL生理鹽水(武漢益普生物科技有限公司)的離心管中，取100 μL于離心管中，采用離心機(jī)(上海臻諾生物科技有限公司，型號(hào)ThermoFisher)10 000 r/min離心10 min，棄上清；采用DNA提取試劑盒(廣州健侖生物科技有限公司)提取沉淀細(xì)胞中的DNA，以此DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取一支潔凈離心管，分別加入DNA 5 μL、陰性質(zhì)控品5 μL、陽性質(zhì)控品5 μL，將管蓋蓋緊，瞬時(shí)離心后進(jìn)行q-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性10 s、62 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)，根據(jù)Ct值和擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果，Ct值<38判定為HPV感染陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中SFRP基因甲基化率

結(jié)果顯示，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP基因甲基化率高于配對(duì)癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中SFRP基因甲基化率比較Tab.1 Comparison of methylation rate of SFRP gene between cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 不同臨床病理特征的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率

結(jié)果顯示，不同年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同WHO病理分級(jí)、FIGO分期的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率Tab.2 Comparison of methylation rate of SFRP gene among patients with different clinicopathological characteristics

2.3 HPV感染子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率

結(jié)果顯示，HPV感染陽性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率高于HPV感染陰性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同HPV感染情況的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率Tab.3 Comparison of methylation rate of SFRP gene among patients with different HPV infection status

2.4 Spearman相關(guān)分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，SFRP基因甲基化率與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度無相關(guān)性(P>0.05)，與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者WHO病理分級(jí)、FIGO分期、HPV感染呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 SFRP基因甲基化率與患者臨床病理特征及HPV感染的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation between the methylation rate of SFRP gene and the clinicopathological characteristics and HPV infection

3 討論

早期子宮頸癌通常無明顯癥狀和體征，隨著病情進(jìn)展，根據(jù)病灶累及范圍的大小可出現(xiàn)陰道排液、陰道流血、尿急、尿頻、便秘、下肢腫痛、腎盂積水、輸尿管梗阻、尿毒癥、貧血等繼發(fā)性癥狀[7]。目前臨床采用以手術(shù)和放射性治療為主、化學(xué)藥物治療為輔的綜合治療方案，雖然能夠改善患者臨床癥狀、控制亞臨床轉(zhuǎn)移、縮小腫瘤病灶及延長生存時(shí)間，但晚期子宮頸癌治療比較困難，常因遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)導(dǎo)致治療失敗，預(yù)后較差[7-9]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提升子宮頸癌預(yù)后的關(guān)鍵。

HPV是一種球形DNA病毒，屬于乳多空病毒科，能引起人體皮膚或黏膜的鱗狀上皮增殖，引起人類上皮的惡性腫瘤和良性腫瘤，如尖銳濕疣、子宮頸癌、肛門癌等，近年來HPV感染受到諸多臨床工作者的廣泛關(guān)注[10-11]。據(jù)報(bào)道14～59歲人群HPV總感染率為26.8%，其感染途徑包括性傳播、密切接觸、間接接觸、醫(yī)源性感染、母嬰傳播[12]。HPV感染是引發(fā)子宮頸癌的主要生物學(xué)因素，與子宮頸癌發(fā)病過程密切相關(guān)。除此之外，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谧訉m頸癌發(fā)病過程中也具有重要作用[4]。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)作用下，甲基基團(tuán)與基因組中胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cytosine guanine dinucleotides，CpG)的胞嘧啶環(huán)第5碳原子以穩(wěn)定的共價(jià)鍵形式結(jié)合而形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)的化學(xué)修飾過程，該過程能夠在不涉及DNA序列變化的前提下改變遺傳表現(xiàn)，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、DNA構(gòu)象改變、DNA穩(wěn)定性改變、DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式改變，調(diào)控基因表達(dá)[13-15]。有研究顯示抑癌基因甲基化異常與子宮頸癌相關(guān)[16]。Wnt信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上非常保守的具有傳遞生長刺激信號(hào)功能的信號(hào)途徑，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胚胎發(fā)育、中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成等方面發(fā)揮重要作用[17-19]。SFRP是Wnt信號(hào)通路的拮抗因子，可通過CRD與Wnt配體結(jié)合而阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)[20-21]。SFRP基因是一種抑癌基因，能夠抑制腫瘤增殖，其基因多態(tài)性是部分惡性腫瘤的高危因素[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞株及口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中SFRP基因有較高的甲基化率[24-25]。本研究顯示子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP基因甲基化率高于配對(duì)癌旁正常組織，提示子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者存在明顯SFRP基因甲基化，可能與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示不同年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同WHO病理分級(jí)、FIGO分期的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與WHO病理分級(jí)、FIGO分期呈正相關(guān)，提示SFRP基因甲基化與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌惡性進(jìn)展有一定關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HPV感染陽性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率高于HPV感染陰性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，并且子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與HPV感染呈正相關(guān)，提示SFRP基因甲基化的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者發(fā)生HPV感染的可能性越大。

綜上所述，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與患者的WHO病理分級(jí)、FIGO分期、HPV感染呈正相關(guān)，SFRP有望成為子宮頸鱗狀細(xì)胞癌診斷的生物標(biāo)志物。但本研究納入病例數(shù)不足，有待進(jìn)一步加大樣本量及多中心研究。