吳小海， 劉曉曉， 張宏偉， 李夢仙， 溫艷萍， 李明陽， 吳翰欣， 張沛， 俞建昆**

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650000； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118； 3.昆明醫(yī)科大學(xué) 第二附屬醫(yī)院， 云南 昆明 650000)

肺癌是目前人類發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，但發(fā)病機制尚不清楚[1-2]。順鉑(Cis-diaminodichloroplatin,CDDP)是一種廣泛運用在癌癥臨床治療中的鉑類化療藥物，可使細(xì)胞的DNA產(chǎn)生交聯(lián)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[3]。用CDDP處理細(xì)胞，隨著用量的提高，細(xì)胞的凋亡水平亦越高，各種基因的表達(dá)調(diào)控也隨之變化[4]。哺乳動物細(xì)胞前體mRNA(pre-mRNA)選擇性剪接被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的一個重要層面，可以調(diào)控不同組織和疾病狀態(tài)下基因的表達(dá)模式，異常的選擇性剪接則與癌癥有關(guān)，可調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)量或產(chǎn)生多種蛋白異構(gòu)體，也可能產(chǎn)生一些截短的甚至功能相反的蛋白質(zhì)，從而影響細(xì)胞的凋亡和耐藥性[5-6]。NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶2(NOP2/Sun RNA methyltransferase 2，NSUN2)是一種RNA甲基修飾酶，能把S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到RNA上胞嘧啶的5號位點上，使胞嘧啶甲基化成5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)[7-9]，這種甲基化修飾方式在tRNA穩(wěn)定性、RNA轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)及mRNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控等方面有重要作用[10-13]；NSUN2還能通過多種通路促進(jìn)癌細(xì)胞的生長[14-15]，并在細(xì)胞抵抗氧化壓力時發(fā)揮重要應(yīng)激作用[16]。RNA的甲基化是一種非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，是表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要部分[17]，RNA甲基化廣泛存在于各種RNA中[18-19]，其中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)甲基化研究較多，m5C甲基化研究則較少，而RNA的m5C甲基化修飾存在于幾乎所有類型的RNA中，其表達(dá)水平異常與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)缺陷、心血管系統(tǒng)疾病和異常分化等疾病密切相關(guān)[20]。因此有必要對RNA m5C甲基化的關(guān)鍵基因NSUN2的調(diào)控方式進(jìn)行研究，NCBI的數(shù)據(jù)庫顯示NSUN2存在多個mRNA剪接異構(gòu)體，本研究擬通過檢測分析在順鉑處理的肺癌細(xì)胞系和肺癌臨床樣本中NSUN2 pre-mRNA的剪接變化，為探究NSUN2的pre-mRNA選擇性剪接調(diào)控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞和標(biāo)本 人肺癌細(xì)胞系H1299細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動物所細(xì)胞中心；選取2018年1—6月胸外科非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織及其癌旁正常組織，肺癌的診斷經(jīng)組織病理學(xué)證實，共納入患者16例，男性8例、女性8例，年齡42～70歲、平均(56.9±7.3)歲，腫瘤直徑>3cm 9例、腫瘤直徑≤3cm 7例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期12例、Ⅲ～Ⅳ期4例。

1.1.2主要藥品和儀器 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Corning，批號10040014)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；以色列Biological Industries，批號1534372)，CDDP(昆明貴研藥，批號S20161003)，RNAiso Plus(日本TakaRa，批號AKA4302)、oligo(dT)23及Hiscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(南京Vazyme，批號7E250B8)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海捷瑞，批號GR301G11X)，5 min TM TA/Blunt-Zero 克隆試劑盒(南京Vazyme，批號7E260K8)，質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號s7605)及ChemiDoc MP凝膠成像儀(美國BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和H1299 細(xì)胞使用含100 000 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)至對數(shù)增長期；DMSO避光溶解CDDP后按梯度濃度分別加入各組細(xì)胞的培養(yǎng)基中處理細(xì)胞，按加入CDDP濃度的不同，A549細(xì)胞分為0、8、16、24、32、40、48及56 μmol/L共8組，H1299細(xì)胞則分為0、12、24、36、48、60、72及84 μmol/L共8組。

1.2.2細(xì)胞和標(biāo)本組織的NSUN2 各mRNA剪接異構(gòu)體的表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測，取CDDP處理24 h后各組細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS沖洗，除去PBS，加RNAiso Plus吹打，至細(xì)胞充分裂解；同時臨床標(biāo)本組織塊在RNAiso Plus中勻漿至充分裂解，分別按照試劑說明書程序提取細(xì)胞和臨床標(biāo)本組織總RNA。以oligo(dT)23為引物，用Hiscript II逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA；在NSUN2 pre-mRNA剪接形式多樣的位置設(shè)計引物NSUN2 F為CACCACTGCTCCTCAACGTG，NSUN2 R為CTCTTGGCTTGATGGACGAGC；加入等量cDNA模板，反應(yīng)總體積15 μL，擴增程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，循環(huán)35次，最后72 ℃終延伸5 min；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，并用ChemiDoc MP凝膠成像儀成像自帶分析軟件(Impage Lab)對各個目標(biāo)條帶進(jìn)行定量。

1.2.3RT-PCR產(chǎn)物的TA克隆(original TA cloning kit)與測序 切下含有RT-PCR產(chǎn)物目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，用5 min TM TA/Blunt-Zero克隆試劑盒將回收的目的片段與含有氨芐青霉素抗性基因的載體進(jìn)行連接，構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，再用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，將其擴大培養(yǎng)后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行一代測序(Sanger法)得到每個RT-PCR產(chǎn)物的DNA序列。

1.2.4生物信息網(wǎng)站比對 將RT-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與生物信息網(wǎng)站(NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov；UCSC：http://genome.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，根據(jù)目前公開發(fā)表的數(shù)據(jù)信息顯示，NSUN2的mRNA剪接異構(gòu)體只有4種：不可編碼蛋白的異構(gòu)體A不含第6、7外顯子、可編碼蛋白的異構(gòu)體B和C只保留第6外顯子、會產(chǎn)生提前終止密碼子(premature termination codon, PTC)，而不可編碼蛋白的異構(gòu)體D只保留第7外顯子(圖1)。

1.2.5核酸序列比對和翻譯 使用Lasergene中的Megalign軟件比對RT-PCR產(chǎn)物序列和其可能編碼的氨基酸序列，使用Lasergene中的Editseq軟件將mRNA剪接異構(gòu)體的全長編碼序列(coding sequence，CDS)翻譯成氨基酸序列，觀察是否有PTC出現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞NSUN2 mRNA剪切異構(gòu)體的變化

mRNA剪接異構(gòu)體檢測引物NSUN2 (F,R)分別設(shè)計在NCBI編號NM_017755.6的mRNA(異構(gòu)體B)的第5外顯子(exon5)和第7外顯子(exon8)上，目的條帶為102 bp(異構(gòu)體A)、187 bp(異構(gòu)體B、C)及244 bp(異構(gòu)體D，圖1)；RT-PCR檢測結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞系中NSUN2可編碼蛋白的mRNA剪接異構(gòu)體B和C(187 bp)的表達(dá)量最高，在NSUN2總mRNA的表達(dá)中占主導(dǎo)地位，非編碼mRNA剪接異構(gòu)體A(102 bp)表達(dá)量極少，出現(xiàn)了一條330 bp左右的不明條帶(圖2A和2B)，該不明條帶在隨后測序鑒定中確定為未見報道的mRNA剪接異構(gòu)體E(329 bp)和F(331 bp)。RT-PCR產(chǎn)物各條帶的量化結(jié)果顯示，與CDDP濃度0 μmol/L的對照組比較，隨著加入CDDP濃度的升高，NSUN2可編碼蛋白的mRNA剪接異構(gòu)體B和C(187 bp)在A549細(xì)胞中表達(dá)量變化不明顯，在H1299細(xì)胞的60 μmol/L及更高濃度處理組中表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；非編碼蛋白的mRNA剪接異構(gòu)體D (244 bp)，在A549細(xì)胞的40 μmol/L及更高濃度處理組、H1299細(xì)胞的36 μmol/L及更高濃度處理組中表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；未見報道的mRNA剪切異構(gòu)體E和F(329/331 bp)，在A549細(xì)胞的32 μmol/L及更高濃度處理組、H1299細(xì)胞的36 μmol/L及更高濃度處理組中表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2C和2D)。

注：方框為外顯子，橫線為內(nèi)含子，灰、白色分別表示以外顯子為編碼蛋白和非編碼的mRNA剪接異構(gòu)體；A～F為異構(gòu)體編號，1～8為外顯子編號，第7外顯子長度有142 bp和144 bp；箭頭表示引物設(shè)計位點。圖1 NSUN2 mRNA的剪接異構(gòu)體及引物設(shè)計位點Fig.1 Splicing isoforms of NSUN2 mRNA and primer design sites

注：A、B分別為梯度濃度CDDP處理的A549和H1299細(xì)胞中NSUN2的RT-PCR產(chǎn)物圖(上為增強曝光，下為正常曝光；M為100 bp ladder maker)，C、D分別為A549和H1299中各目的條帶相對表達(dá)量；與0 μmol/L CDDP比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖2 不同濃度CDDP處理A549和H1299細(xì)胞中NSUN2 mRNA剪接異構(gòu)體的表達(dá)(RT-PCR)Fig.2 Expressions of NSUN2 mRNA isoforms in A549/H1299 cells treated by cisplatin(RT-PCR)

2.2 肺癌臨床樣本中NSUN2 mRNA剪切異構(gòu)體的變化

RT-PCR結(jié)果顯示，肺癌臨床樣本中檢測到了102、187、244和329/331 bp大小的RT-PCR產(chǎn)物條帶，其中可編碼蛋白的mRNA剪接異構(gòu)體B和C(187 bp)的表達(dá)量最高，在NSUN2總mRNA的表達(dá)中占主導(dǎo)地位，未見報道的2種NSUN2 mRNA剪切異構(gòu)體E和F(329/331 bp)在癌組織與癌旁組織中均有微弱表達(dá)。在所檢測的16例肺癌患者中，多數(shù)患者癌組織與癌旁正常組織中NSUN2 mRNA剪切異構(gòu)體的表達(dá)存在差異，少數(shù)患者沒有明顯變化(圖3)。

注：數(shù)字為患者編號，C為癌組織，N為癌旁組織；M為100 bp ladder maker。圖3 肺癌組織標(biāo)本中NSUN2 mRNA剪接異構(gòu)體的表達(dá)(RT-PCR)Fig.3 Expressions of NSUN2 mRNA splicing isoforms in lung cancer tissue samples(RT-PCR)

2.3 未見報道的NSUN2mRNA剪接異構(gòu)體的測序鑒定

H1299細(xì)胞RT-PCR產(chǎn)物中330 bp左右的條帶進(jìn)行切膠回收并測序(圖4)，確定該條帶為同時保留圖1中第6、7外顯子的異構(gòu)體E(329 bp)及異構(gòu)體F(331 bp)2種未有報道的mRNA剪接異構(gòu)體，異構(gòu)體F在exon7前多剪接進(jìn)了2個堿基(圖4B)，剪接異構(gòu)體E和F在NCBI、UCSC網(wǎng)站數(shù)據(jù)中均未見報道。

注：A為異構(gòu)體A～E的序列對比，B為異構(gòu)體F與E的序列對比。圖4 NSUN2 mRNA剪接異構(gòu)體的核酸序列對比Fig.4 Nucleic acid sequence comparison of NSUN2 mRNA splicing isoforms

2.4 NSUN2未有報道的mRNA剪切異構(gòu)體編碼蛋白質(zhì)情況

結(jié)果顯示，NSUN2 未見報道的mRNA剪接異構(gòu)體E無論是否含有exon3均會產(chǎn)生提前PTC，無法編碼完整蛋白質(zhì)，預(yù)測異構(gòu)體E-1含exon3、CDS共2 446 bp在第664～666位會產(chǎn)生“TGA”提前PTC，異構(gòu)體E-2不含exon3、CDS共2 341 bp在第559～561位會產(chǎn)生“TGA”提前PTC(圖5A)；剪接異構(gòu)體F無論是否含有exon3均可以編碼完整蛋白質(zhì)(圖5B)，預(yù)測異構(gòu)體F-1含exon3、CDS共2 448 bp可編碼816個氨基酸，異構(gòu)體F-2不含exon3、CDS共2 343 bp可編碼781個氨基酸(表1)。

表1 NSUN2 mRNA剪接異構(gòu)體F可能編碼的蛋白序列Tab.1 The possible scriptable protein sequence by NSUN2 mRNA splicing isoform F

注：A為異構(gòu)體E、包含exon3與不含exon3的氨基酸序列對比，B為異構(gòu)體F、含exon3與不含exon3的氨基酸序列對比。圖5 NSUN2 mRNA剪接異構(gòu)體E和F可能翻譯的氨基酸序列對比Fig.5 Comparison of possible translatable amino acid sequence by the NSUN2 mRNA splicing isoform E and F

3 討論

對RNA的m5C甲基化修飾的初步研究揭示其在基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控中有著重要作用，而NSUN2是RNA m5C修飾的關(guān)鍵基因[10]。引物NSUN2 (F，R)在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中檢測到了5種mRNA剪接異構(gòu)體，加上包含和不包含exon3的2種情況，可能存在8種mRNA剪接異構(gòu)體，這些異構(gòu)體在不同組織和不同疾病中是否有不同的表達(dá)情況和功能差異，值得進(jìn)一步研究探討。從檢測結(jié)果來看，人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中，編碼NSUN2蛋白的mRNA剪接異構(gòu)體B、C占主導(dǎo)地位，在CDDP處理下與CDDP濃度0 μmol /L的對照組比較，隨著CDDP濃度的升高，細(xì)胞的凋亡程度加劇，這2種異構(gòu)體在A549細(xì)胞中表達(dá)量變化不顯著，在H1299細(xì)胞的60 μmol/L及更高濃度處理組中表達(dá)量下降；非編碼蛋白的mRNA剪接異構(gòu)體D 在A549細(xì)胞的40 μmol/L及更高濃度組和H1299細(xì)胞的36 μmol/L及更高濃度組中表達(dá)量上升；未有報道的mRNA剪切異構(gòu)體E和F在所檢測的2種細(xì)胞系中的表達(dá)量比較低，在A549細(xì)胞的32 μmol/L及更高濃度組和H1299細(xì)胞的36 μmol/L及更高濃度組中表達(dá)量上升。細(xì)胞在應(yīng)激條件下的基因表達(dá)和正常狀態(tài)下不同，且基因的表達(dá)調(diào)控是多級干預(yù)的高度動態(tài)的生物過程[21-23]。細(xì)胞在壓力下許多基因pre-mRNA的選擇性剪接會發(fā)生變化，一些異構(gòu)體升高，而另一些異構(gòu)體下降，有些異構(gòu)體會因pre-mRNA的剪接變化造成讀碼框移動從而產(chǎn)生PTC，這些含有PTC的mRNA 剪接異構(gòu)體會被mRNA表達(dá)監(jiān)控機制NMD(無義介導(dǎo)的mRNA降解nonsense-mediated mRNA decay)所降解，如果基因的pre-mRNA剪接變化是使含PTC的異構(gòu)體比例升高，而不含PCT的能編碼蛋白的異構(gòu)體下降，這樣會降低編碼蛋白的mRNA水平，下調(diào)該基因的表達(dá)水平[24-25]。本文結(jié)果提示NSUN2在CDDP處理的肺癌細(xì)胞中的表達(dá)可能就是通過這一機制來調(diào)控的。

異構(gòu)體E和F(RT-PCR產(chǎn)物329/331 bp)在肺癌臨床樣本中也有表達(dá)，說明異構(gòu)體E和F不只是在細(xì)胞系中表達(dá)，但癌組織里和癌旁組織里的異構(gòu)體E和F表達(dá)量沒有顯著差別，而在高濃度CDDP處理的肺癌細(xì)胞系中異構(gòu)體E和F的表達(dá)量升高，它們是否有一定功能有待進(jìn)一步研究。異構(gòu)體E和F在測序確定了mRNA序列后進(jìn)一步的預(yù)測其氨基酸序列，明確了異構(gòu)體E含有PTC不能編碼完整蛋白，而剪切異構(gòu)體F可以編碼完整蛋白質(zhì)。在本研究的RT-PCR產(chǎn)物329/331bp條帶中是異構(gòu)體E和F的哪一種占主導(dǎo)，也待進(jìn)一步研究分析，而異構(gòu)體F可能翻譯出的蛋白質(zhì)究竟有何功能，還有待研究。

綜上所述，NSUN2對mRNA的m5C甲基化修飾是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一種重要方式，因此該基因的表達(dá)調(diào)控是值得關(guān)注的研究方向。本研究結(jié)果提示，NSUN2基因在CDDP處理下，其pre-mRNA在選擇性剪接層面上存在一定的表達(dá)調(diào)控，該基因的選擇性剪接調(diào)控值得進(jìn)一步研究探討。