王菊， 李龍， 曾家順

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 風濕免疫科， 貴州 貴陽 550004)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎性、侵蝕性自身免疫疾病，主要攻擊滑膜關節(jié)，基本病理特征主要表現(xiàn)為滑膜炎癥及增生、血管翳形成、軟骨及骨破壞，最終導致關節(jié)畸形和功能障礙[1]。盡管在過去十幾年中，聯(lián)合療法和免疫療法有效改善了RA的炎癥表現(xiàn)，減緩了RA的進展，但RA目前仍是無法治愈的疾病[2-3]。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是RA患者滑膜組織中的主要細胞類型之一，F(xiàn)LS活化在啟動和驅(qū)動RA中起著關鍵作用，活化的FLS具有“腫瘤樣”細胞的特征，存在異常增殖過度和凋亡不足，是導致RA滑膜增生和慢性炎癥的重要效應細胞[4-5]。因此，如何有效地抑制FLS增殖、促進其凋亡將成為治療RA的關鍵。桔梗皂苷D(platycodin D，PD)是從中藥桔梗中提取的一種五環(huán)三萜皂苷類單體，是桔梗的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、減脂、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等多種藥理作用，在抗腫瘤的研究中被證實能有效抑制肺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤細胞的增殖和促進其凋亡[6-7]。在抗RA的研究中，有研究表明PD對膠原誘導的類風濕關節(jié)炎小鼠有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，是一種有效抗風濕性關節(jié)炎的新型藥物[8]。然而，PD對RA中具有“腫瘤樣”細胞特征的FLS是否有影響、以及在RA治療中的作用機制，尚不十分清楚，仍有待進一步研究。本實驗采用人類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞株MH7A細胞，建立RA體外細胞模型[9]，探索PD對MH7A細胞增殖和凋亡的影響，研究PD治療RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和主要試劑

RA樣FLS細胞MH7A購自北納生物有限公司。PD(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司,二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司,DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、雙抗購自美國Gibco公司,CCK-8試劑盒、細胞凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒購自貴州泰思騰生物科技有限公司,Western blot抗體Bcl-2、Bax、Caspase-9、β-actin以及Western blot二抗購自美國Genetex公司,ECL PLUS試劑盒、Western及IP細胞裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白定量試劑盒購自中國上海碧云天生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1PD的制備 取PD 20 mg，加DMSO 200 μL溶解，然后用直徑0.22 μm的無菌濾器進行過濾，放入無菌棕色避光小玻璃瓶中，密封后置于4 ℃冰箱保存；使用時從冰箱取出，加適量DMEM培養(yǎng)基，配制成實驗所需濃度，DMSO的終濃度含量為0.05%。

1.2.2細胞培養(yǎng) MH7A細胞的培養(yǎng)條件：含15%FBS和1%雙抗的DMEM細胞培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當MH7A細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底70%～80%，用3 mL移液管吸取PBS洗3次，用含0.25%胰蛋白酶消化液消化細胞，用含血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止細胞消化，按1 ∶2進行細胞傳代，完成相關實驗。

1.2.3CCK-8實驗檢測MH7A細胞的增殖率 取對數(shù)期正常生長的MH7A細胞，消化、離心收集細胞，計數(shù)板下計數(shù)，制成5×107個/L單細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板。放入培養(yǎng)箱中靜置過夜，待細胞貼壁生長24 h后，將原培養(yǎng)基更換為含PD藥物(濃度分別為5、10、15、20、25及30 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基、繼續(xù)培養(yǎng)。同時設置空白對照組(無PD，含0.05%DMSO的DMEM培養(yǎng)基)；分別培養(yǎng)24 h后，吸去含藥培養(yǎng)基，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基檢測液，37 ℃避光反應1 h，450 nm處讀取各孔光密度值(OD)值，根據(jù)各孔OD值計算MH7A細胞增殖率。

1.2.4流式細胞儀檢測MH7A細胞的凋亡率 取對數(shù)期正常生長的MH7A細胞，消化、離心收集細胞，計數(shù)板下計數(shù)，制成5×108個/L的單細胞懸液，每孔2 mL接種于6孔板。放入培養(yǎng)箱中靜置過夜，待細胞貼壁生長24 h后，將原培養(yǎng)基更換為含PD藥物(濃度分別為5、10和15 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基，同時設置空白對照組(無PD，含0.05%DMSO的DMEM培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化、離心收集細胞，PBS(4 ℃提前預冷)洗滌細胞2次；用500 μL的1×Buffer懸浮細胞，在懸浮細胞液中依次加入5 μL的FITC標記的Annexin V和10 μL的PI，輕輕混勻后于4 ℃避光條件孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，BD Accuri C6 Software軟件分析檢測數(shù)據(jù)。

1.2.5流式細胞儀檢測MH7A細胞周期分布 細胞鋪板及藥物處理方法同細胞凋亡實驗。藥物處理24 h后，消化、離心收集細胞，PBS(4 ℃提前預冷)洗滌細胞2次，加DNA染色綜合染液1 mL，渦旋震蕩混勻后于室溫避光孵育30 min，通過流式細胞儀檢測分析MH7A細胞內(nèi)DNA含量，采用Flowjo軟件分析并計算各時相細胞的百分比。

1.2.6Western blot檢測凋亡相關蛋白表達 取正常培養(yǎng)的對數(shù)生長期的MH7A細胞，將原培養(yǎng)基更換為含PD藥物(濃度分別為5、10和15 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基，同時設置空白對照組(無PD，含0.05%DMSO的DMEM培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化、離心收集細胞，分別收集到1.5 mL EP管中，每管加入細胞裂解液200 μL，提取各組細胞總蛋白，根據(jù)BCA法測定蛋白濃度，加入等體積5×上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min，迅速冰浴中冷卻。根據(jù)目的蛋白分子量制備分離膠和濃縮膠，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，置搖床上緩慢搖動，室溫封閉1 h；分別加相應一抗Caspase-9、Bax、Bcl-2，稀釋比為1 ∶1 000，β-actin稀釋比為1 ∶5 000，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入二抗，稀釋比為1 ∶5 000，于室溫搖床上孵育1 h；TBST洗膜后加入ECL試劑盒中等體積的A液和B液，混勻后加入膜表面，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影成像。采用Image J軟件分析各條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參對照，分析各組目的蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PD對MH7A細胞增殖率的影響

CCK-8檢測結(jié)果如圖1所示，與空白對照組比較，不同濃度PD作用MH7A細胞24 h，PD在5 mg/L濃度以上時，隨著藥物濃度的增加，MH7A細胞增殖率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示PD能抑制MH7A細胞的增殖，且在一定濃度范圍內(nèi)隨藥物濃度的增加，細胞增殖率下降越明顯。基于本實驗結(jié)果，當PD藥物濃度≥20 mg/L，具有細胞毒性。因此，在后續(xù)實驗中，選擇作用細胞的PD濃度為5、10和15 mg/L。

注：(1)與空白對照組比較，P<0.01。圖1 PD對MH7A細胞增殖的影響Fig.1 Effect of PD on proliferation of MH7A cells

2.2 PD對MH7A細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖2所示,與空白對照組比較，PD藥物各濃度組MH7A細胞均出現(xiàn)明顯凋亡，且隨著藥物濃度的增加，MH7A細胞凋亡率增加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而空白對照組細胞凋亡率<5%。提示PD能誘導MH7A細胞凋亡。

注：A圖為流式細胞儀檢測分析圖， B圖為細胞凋亡率統(tǒng)計結(jié)果；(1)與空白對照組比較，P<0.01。圖2 PD對MH7A細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of PD on apoptosis of MH7A cells

2.3 PD對MH7A細胞周期分布的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖3所示，與空白對照組比較，隨著PD藥物濃度的增加，MH7A細胞周期分析中G0/G1期細胞比例均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；S期細胞比例無明顯變化趨勢，G2/M期細胞比例在15 mg/L濃度組中顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。提示PD可誘導MH7A細胞G0/G1期生長阻滯。

注：A為流式細胞儀檢測分析圖，B、C、D為細胞周期中G0/G1期、S期、G2/M期細胞占比圖；與空白對照組比較，(1)P<0.05，(2) P<0.01。圖3 PD對MH7A細胞周期分布的影響Fig.3 Effect of PD on cell cycle distribution of MH7A cells

2.4 PD對MH7A細胞相關凋亡蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果如圖4所示，與空白對照組比較，PD藥物各濃度組Caspase-9蛋白相對表達量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；PD藥物各濃度組Bax蛋白相對表達量升高，其中10和15 mg/L濃度組升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；PD藥物各濃度組細胞內(nèi)Bcl-2蛋白相對表達量均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。提示PD能調(diào)控MH7A細胞內(nèi)線粒體凋亡途徑促進細胞凋亡發(fā)生。

注：A為各蛋白表達結(jié)果，B、C、D分別為Bcl-2、Bax、Caspase-9的相對表達量統(tǒng)計結(jié)果；與空白對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 PD對MH7A細胞相關凋亡蛋白表達的影響Fig.4 Effect of PD on expression of protein related to apoptosis of MH7A cell

3 討論

近年來，中藥有效成分抗風濕治療的研究己成為當今醫(yī)學研究的熱點,很多學者從RA中FLS細胞的增殖與凋亡角度出發(fā)，用中藥及中藥有效單體進行干預，取得了一定的成果[10-11]。RA中FLS細胞表現(xiàn)出過度增殖和凋亡不足的腫瘤細胞樣性質(zhì)，是導致RA滑膜增生的主要原因[12]。PD是桔梗藥材中含量相對較高的一種皂苷成分，在抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面均表現(xiàn)出良好的藥理活性,能有效抑制腫瘤細胞增殖和誘導其凋亡[6,13]。有體內(nèi)研究表明，桔梗皂苷D對CIA鼠有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫的作用[8]，但對于PD治療RA的作用機制知之甚少。因此，本研究使用不同濃度的PD作用于體外培養(yǎng)的MH7A細胞后，發(fā)現(xiàn)PD能明顯抑制MH7A細胞增殖，并有效促進MH7A細胞凋亡。為進一步探討PD抑制MH7A細胞增殖和誘導其凋亡的作用機制，本實驗檢測了細胞周期的分布情況和Bax、Bcl-2、 Caspase-9的蛋白表達情況。實驗結(jié)果顯示，PD作用MH7A后，可將細胞阻滯在G0/G1期，細胞內(nèi)Bax、Caspase-9蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達降低。

哺乳動物正常細胞的細胞周期是非常復雜和精細的調(diào)節(jié)過程，分為DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)共4個階段[14]。細胞的正常生長依賴于細胞周期中各種調(diào)節(jié)因子的平衡,細胞周期紊亂是腫瘤細胞的一個基本特征，因此可以通過干擾腫瘤細胞的細胞周期來發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。研究表明，RA患者滑膜細胞的增殖水平較正常滑膜細胞明顯要高,表現(xiàn)在細胞增長速度較快，其內(nèi)在機制揭示RA患者滑膜細胞的細胞周期失控，出現(xiàn)G1期細胞明顯減少,而S期、G2期細胞增加，導致滑膜細胞在G2、S期的滯留,使滑膜細胞過度增殖,向腫瘤樣細胞轉(zhuǎn)化，是RA發(fā)病的重要因素[16]。相關研究證明PD能通過阻滯細胞周期抑制腦膠質(zhì)瘤細胞[17]、前列腺癌細胞[18]、肝癌細胞[19]等多種惡性腫瘤細胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。本研究中，用PD作用人類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞MH7A后，MH7A細胞增殖被明顯抑制，為探索其作用機制，進一步檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)PD可將MH7A細胞阻滯在G0/G1期，該期細胞數(shù)量明顯增多，G2/M期細胞數(shù)量減少，說明PD可通過將MH7A細胞阻滯在G0/G1期，減少G2/M期細胞的滯留，抑制MH7A細胞過度增殖。

細胞凋亡是嚴格受基因調(diào)控的程序性細胞死亡的一種生理過程，對多細胞生物的正常發(fā)育和功能平衡至關重要,主要通過外源性或死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑發(fā)生，細胞凋亡異?？蓪е露喾N疾病，包括癌癥、自身免疫疾病和神經(jīng)退行性疾病等[20]。研究表明，RA中滑膜增生與FLS細胞的凋亡缺失密切相關，其中內(nèi)源性線粒體途徑在RA中FLS細胞的凋亡中起關鍵作用[21-22]。內(nèi)源性線粒體凋亡途徑中最關鍵的步驟是Cyt-C從線粒體轉(zhuǎn)移到胞漿，Cyt-C進入胞漿后一旦與細胞內(nèi)存在的細胞蛋白酶激活因子(Apaf-1)相互作用，引發(fā)位于Caspase級聯(lián)反應上游的Caspase-9活化，啟動細胞凋亡發(fā)生[23]。而內(nèi)源性線粒體途徑中Cyt-C釋放與Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)密切相關。Bcl-2家族蛋白包括兩種功能相反的蛋白，即具有抗凋亡作用的Bcl-2、Bcl-xL等蛋白和促凋亡作用的Bax、Bad等蛋白,Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白的比率可協(xié)調(diào)線粒體膜的滲透性，當促凋亡和抑凋亡蛋白的比率升高時可使線粒體膜通透性增加，引起Cyt-C釋放，激活下游Caspases級聯(lián)反應，啟動凋亡[24-25]。在本研究中，PD作用MH7A細胞后，細胞內(nèi)Bax的蛋白表達增加，Bcl-2 的蛋白表達降低，促凋亡Bax蛋白表達和抑凋亡Bcl-2蛋白表達的比率升高，細胞內(nèi)Caspase-9的蛋白表達顯著增加，說明PD可能通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2蛋白表達增加Cyt-C的釋放，激活Caspase級聯(lián)反應上游的Caspase-9來誘導MH7A細胞凋亡。

因此，通過本實驗，初步證明了PD能明顯抑制MH7A細胞增殖，有效促進MH7A細胞凋亡，并推測其作用機制可能是通過將細胞阻滯在G0/G1期和調(diào)控細胞內(nèi)Bax、Bcl-2、Caspase-9的表達從而激活線粒體凋亡途徑發(fā)揮作用，為今后PD治療RA的臨床應用提供了理論基礎。而PD是如何具體調(diào)控細胞周期的分布和激活線粒體凋亡途徑而達到抑制MH7A細胞增殖和誘導其凋亡的作用，及是否還通過其他途徑影響MH7A細胞的增殖和凋亡，將在本研究的基礎上，進一步深入研究和探索。