楊暢， 劉東輝， 宋菲， 王永林， 李勇軍， 蘭燕宇， 陳一飛， 劉亭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心, 貴州 貴陽 550004; 3.上海藥品評(píng)審核查中心, 上海 201203)

細(xì)胞色素P450酶是藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶，參與介導(dǎo)了臨床用藥中約90%的Ⅰ相代謝反應(yīng)[1-4]。由于藥物代謝酶主要負(fù)責(zé)藥物代謝過程，其活性直接影響到藥物的清除。當(dāng)患者同時(shí)服用多種藥物時(shí)，極易發(fā)生由藥物代謝酶活性及表達(dá)量變化所導(dǎo)致的藥物代謝性相互作用，導(dǎo)致藥物療效改變、副作用增加甚至產(chǎn)生毒性反應(yīng)[5-8]。因此，研究藥物對(duì)細(xì)胞色素P450酶的影響對(duì)于臨床合理用藥有著指導(dǎo)意義。羊耳菊[Inulacappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.]為菊科旋覆花屬植物，為貴州、云南、廣西等地方常用藥材，其具有解毒、活血、祛痰等功效，在中醫(yī)臨床上常以全草或根入藥[9-12]。隨著中藥制劑進(jìn)一步開發(fā)，羊耳菊相關(guān)制劑產(chǎn)品也相繼上市，如菊黃上清含片、蓮菊感冒膠囊等，這類藥具有抗菌、抗病毒、抗炎等功效，用于治療呼吸系統(tǒng)疾病，且在臨床上常與其他抗菌藥物聯(lián)用[10,12]。前期研究工作發(fā)現(xiàn)，羊耳菊可影響細(xì)胞色素P450酶的活性，從而影響其他藥物代謝過程[12-13]，但是其機(jī)制尚不清楚。因此，本文提取大鼠原代肝細(xì)胞，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和免疫印跡方法(Western blot)考察不同體積比(0.5%、1%、2%、5%、10%)的羊耳菊含藥血清對(duì)大鼠CYP1A2、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1、CYP3A2酶表達(dá)量的影響，以期闡明羊耳菊影響大鼠肝細(xì)胞色素P450活性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1受試藥材 羊耳菊購自貴州省龍里縣，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室劉春花副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inulacappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的干燥全草。取羊耳菊藥材4 kg，分別加13、10、10倍量60%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并濾液后水浴濃縮。濃縮液用D101型大孔樹脂進(jìn)行富集分離，用水洗脫后直接用60%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液減壓濃縮即得羊耳菊活性部位提取物[9]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體質(zhì)量(210±5)g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào) SCXK(渝) 2015-0001。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，一般狀況正常，隨機(jī)分組進(jìn)行試驗(yàn)。本文所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為1602003。

1.1.3主要試劑 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、鼠尾膠原蛋白Ⅰ型、肝素鈉、RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、Ⅳ型膠原酶(美國Gibco公司)，0.40% 臺(tái)盼藍(lán)染液(美國Bio-Rad公司)，CellTiter 96? AQueous One Solution 細(xì)胞增殖測定試劑盒、Eastep總RNA提取試劑盒(美國Promega公司)，TRIzol試劑(美國Life公司)，SYBR? Premix Ex TaqTM II、PrimeScriptTMRT 試劑盒(大連寶生物有限公司)，兔抗CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4、小鼠抗CYP1A2、β-actin(英國Abcam公司)，兔抗CYP2D4(美國CST公司)，辣根過氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體(美國Thermo公司)，β-actin、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1、CYP3A2的引物由上海生工公司合成，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.1.4主要儀器 Biomate 3S核酸蛋白紫外測定儀、ST40R型臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、TS100F型倒置顯微鏡(日本尼康株式會(huì)社)、Trans-Blot Turbo型蛋白快速轉(zhuǎn)印儀、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司)、ChemiDoc XRS+凝膠成像儀(英國Syngene公司)、Optima XPN型超速離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)、SNAP i.d. 2.0快速孵育儀(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1含藥血清的采集 健康SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為給藥組(5只)和空白組(5只)。給藥組以羊耳菊活性部位提取物(按羊耳菊生藥量計(jì)54 g/kg)灌胃，每天2次，連續(xù)7天，空白組給以相同體積的CMC-Na 。給藥結(jié)束1 h后，經(jīng)股動(dòng)脈取血放置4 ℃冰箱1 h，待全血上層析出黃色液體，收集上清液，于4 ℃ 400 r/min離心10 min，均勻混合同組大鼠血清消除個(gè)體差異。于56 ℃水浴鍋30 min滅活后，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2大鼠原代肝細(xì)胞提取 采用改良的兩步膠原酶灌注法分離提取正常SD大鼠原代肝細(xì)胞[14-15]。大鼠麻醉后仰臥位，開腹，剝離門靜脈(portal vein, PV)和下腔靜脈(inferior vena cava, IVC)。IVC暴露，結(jié)扎IVC通往腎靜脈遠(yuǎn)端和IVC尾端。用止血鉗(夾)夾閉IVC的胸腔段和脾靜脈，沿PV由遠(yuǎn)心端插管緩慢灌注(5 r/min)無Ca2+前灌注液，至大鼠肝臟變?yōu)橥咙S色后更換為原酶灌流液。待大鼠肝臟出現(xiàn)網(wǎng)格狀紋絡(luò)后停止灌注，使用彎鑷固定纖維束并切斷肝臟周邊結(jié)締組織，摘除肝臟后立即轉(zhuǎn)移至無菌環(huán)境下的冰浴分散液的培養(yǎng)皿中。肝細(xì)胞懸液經(jīng)過濾，離心，去上清，重懸后，取90 μL，加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)10 μL混勻，在3 min內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，重復(fù)計(jì)數(shù)3次。細(xì)胞活率達(dá)90%以上即可用于鋪板。在TS100F型倒置顯微鏡下觀察SD大鼠原代肝細(xì)胞分別培養(yǎng)0、6、24和48 h時(shí)的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3大鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 取新鮮分離且成活率>90%的肝細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混懸，接種于鼠尾膠包被板(6孔板：6×105個(gè)/孔)。將細(xì)胞分為對(duì)照組和羊耳菊含藥血清組。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，吸棄培養(yǎng)基。羊耳菊含藥血清組分別加入含有0.5%、1%、2%、5%、10%體積比含藥血清的培養(yǎng)液2 mL，對(duì)照組加入相同比例的空白血清，分別培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.4測定不同亞型細(xì)胞色素P450酶 mRNA表達(dá) 不同濃度的羊耳菊含藥血清孵育結(jié)束后，棄去孵育液，用Trizol和Eastep總RNA提取試劑盒提取各組總RNA。取總RNA 2.0 μg，用SYBR? Premix Ex TaqTM II、PrimeScriptTMRT 試劑盒合成單鏈cDNA。將cDNA稀釋50倍，按說明書用SYBR? Premix Ex TaqTM II進(jìn)行qRT-PCR檢測，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR? Premix Ex TaqTMII 10 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)在CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)；繪制溶解曲線。基因表達(dá)數(shù)據(jù)用內(nèi)參基因β-actin校正，相對(duì)表達(dá)差異采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)[16-17]。

表1 大鼠qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.5測定不同亞型細(xì)胞色素P450酶的蛋白表達(dá) 用RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，按BCA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，按凝膠制備試劑盒說明書制備12% SDS-PAGE凝膠。將測試樣品加入上樣緩沖液并100 ℃水浴10 min，取樣品蛋白30 μg上樣，先在電壓80 V條件下電泳20 min，然后在電壓120 V條件下繼續(xù)電泳60 min。電泳結(jié)束后，剪切PVDF膜，用甲醇潤濕，按濾紙+膜+膠+濾紙的順序搭建轉(zhuǎn)膜裝置，放入轉(zhuǎn)印儀中，恒壓25 V轉(zhuǎn)膜30 min。將PVDF膜放于SNAP快速轉(zhuǎn)膜儀的印跡支架中，加入BSA封閉液處理20 min，然后一抗孵育20 min，TBST洗滌液洗3 min，洗滌完畢后加入二抗進(jìn)行孵育10 min。之后TBST洗滌液洗滌3 min；封閉孵育完畢后ECL發(fā)光液室溫反應(yīng)1 min。于凝膠成像儀器中拍照，觀察蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代肝細(xì)胞的提取

本實(shí)驗(yàn)用改良的兩步膠原酶灌注法，平均每只鼠肝獲取(1.15±0.27)×108個(gè)肝細(xì)胞，平均細(xì)胞活力(97.4±1.2)%，細(xì)胞產(chǎn)量較高、且活性好。新鮮分離的大鼠原代肝細(xì)胞呈離散狀、單個(gè)分布(圖1A)；培養(yǎng)6 h，部分細(xì)胞貼壁，平鋪面積增大，能夠觀察到肝細(xì)胞為單核、雙核或多核細(xì)胞(圖1B)；培養(yǎng)24 h，細(xì)胞體積增大，邊緣伸展，排列成肝索結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出多角形，細(xì)胞間開始出現(xiàn)島嶼狀連接(圖1C)；培養(yǎng)48 h時(shí)呈板片狀連接，細(xì)胞胞體變平變薄，胞質(zhì)色淡，形態(tài)不規(guī)則(圖1D)。顯微鏡下形態(tài)觀察結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所分離的大鼠原代肝細(xì)胞純度較高，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

注：A為新分離的大鼠原代肝細(xì)胞(×100)，B為孵育6 h后的原代肝細(xì)胞(×100)，C為孵育24 h后的原代肝細(xì)胞(×100)，D為孵育48 h后的原代肝細(xì)胞(×200)。圖1 孵育不同時(shí)間的大鼠原代肝細(xì)胞Fig.1 Morphology change of rat primary hepatocytes with different culture time

2.2 羊耳菊含藥血清對(duì)不同亞型大鼠肝細(xì)胞色素P450酶mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR測定結(jié)果示，與對(duì)照組比較，羊耳菊作用24 h，羊耳菊含藥血清可以顯著增加CYP1A2和CYP2E1 mRNA表達(dá)(P<0.01)，但CYP2C19和CYP2D4 mRNA表達(dá)量沒有明顯變化(P>0.05)，僅高濃度(5%和10%羊耳菊)時(shí)CYP3A2表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。與對(duì)照組比較，羊耳菊作用48 h，對(duì)CYP1A2和CYP2E1 mRNA表達(dá)水平影響不明顯(P>0.05)，CYP2C19和CYP2D4 mRNA表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，并在高濃度時(shí)(10%羊耳菊)CYP3A2 mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 羊耳菊含藥血清作用24 h對(duì)CYP450s mRNA表達(dá)的影響Tab.2 Effects of serum containing extracts from Inula cappa on mRNA expressions of CYP450s in primary rat hepatocytes after 24 h treatment

表3 羊耳菊含藥血清作用48 h后對(duì)CYP450s mRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effects of serum containing extracts from Inula cappa on mRNA expressions of CYP450s in primary rat hepatocytes after 48 h treatment

2.3 羊耳菊含藥血清對(duì)原代肝細(xì)胞色素P450酶蛋白表達(dá)的影響

羊耳菊含藥血清作用24 h, 在羊耳菊含藥血清濃度為0.5%、1%、2%、5%、10%時(shí)肝細(xì)胞中CYP1A2和CYP2E1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，見圖2和圖3；作用48 h，CYP1A2在各組肝細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2；而在含藥血清濃度為5%和10%時(shí)肝細(xì)胞中CYP2E1蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。羊耳菊含藥血清作用24 h，對(duì)CYP2C19和CYP2D4的蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05)，見圖4和圖5；作用48 h，在羊耳菊含藥血清濃度為0.5%、5%、10%時(shí)，肝細(xì)胞中CYP2C19蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，見圖4；但對(duì)CYP2D4的蛋白表達(dá)無顯著影響(P>0.05)，見圖5。低濃度含藥血清(0.5%、1%、2%羊耳菊)對(duì)CYP3A2蛋白的表達(dá)影響不明顯(P>0.05)，但在高濃度(5%和10%羊耳菊)時(shí)，作用24 h CYP3A2蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，作用48 h CYP3A2蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，見圖6。

注：A為Western blot電泳條帶，B為Western blot直條圖；(1)與對(duì)照組相比，P<0.01。圖2 羊耳菊含藥血清對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中 CYP1A2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of serum containing extracts from Inula cappa on CYP1A2 protein expression in primary rat hepatocytes

注：A為Western blot電泳條帶，B為Western blot直條圖；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；(2)P<0.01。圖3 羊耳菊含藥血清對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中的CYP2E1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of serum containing extracts from Inula cappa on CYP2E1 protein expression in primary rat hepatocytes

注：A為Western blot電泳條帶，B為Western blot直條圖；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；(2)P<0.01。圖4 羊耳菊含藥血清對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中的CYP2C19蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of serum containing extracts from Inula cappa on CYP2C19 protein expression in primary rat hepatocytes

注：A為Western blot電泳條帶，B為Western blot直條圖。圖5 羊耳菊含藥血清對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中的CYP2D4蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of serum containing extracts from Inula cappa on CYP2D4 protein expression in primary rat hepatocytes

注：A為Western blot電泳條帶，B為Western blot直條圖；與對(duì)照組比較，(1)P<0.05；(2)P<0.01。圖6 羊耳菊含藥血清對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中的CYP3A2蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of serum containing extracts from Inula cappa on CYP3A2 protein expression in primary rat hepatocytes

3 討論

細(xì)胞色素P450中，CYP3A4、CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和 CYP2E1負(fù)責(zé)了大部分的藥物代謝[18-20]。人CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4與大鼠CYP1A2、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1、CYP3A2具有高度同源性[13,18,20-22]。因此，本研究選擇大鼠的CYP1A2、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1和CYP3A2為主要考察對(duì)象。中藥成分經(jīng)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后不一定以原型形式存在，利用含藥血清研究中藥藥理機(jī)制已成為常見手段[23-26]。因此，本研究用羊耳菊含藥血清來開展相關(guān)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)羊耳菊含藥血清孵育24 h，大鼠原代肝細(xì)胞中CYP1A2、CYP2E1和CYP3A2 mRNA和蛋白水平均有一定程度的上調(diào)。但孵育48 h，CYP1A2和CYP2E1 mRNA表達(dá)恢復(fù)到原水平。在10%含藥血清組中CYP3A2 mRNA和蛋白表達(dá)被抑制(P<0.05)。CYP2C19的mRNA和蛋白表達(dá)在含藥血清孵育48 h上調(diào)(P<0.05)，但在孵育24 h未觀察到顯著變化。給藥24 h和48 h，CYP2D4的表達(dá)無明顯變化。課題組前期用cocktail探針法[12]，探究了羊耳菊對(duì)大鼠體內(nèi)活性的影響，結(jié)果表明在治療第7或14 天時(shí)羊耳菊對(duì)大鼠肝藥酶CYP3A2、CYP1A2和CYP2C19的活性具有不同程度的抑制作用，其中對(duì)CYP3A2的抑制作用最強(qiáng)。采用肝微粒體體外孵育技術(shù)結(jié)合“Cocktail 探針?biāo)幬锓ā笨疾煅蚨仗崛∥飳?duì)人和大鼠肝微粒體中細(xì)胞色素P450酶的影響[13]，也均表明存在較弱的抑制作用。但是本文發(fā)現(xiàn)羊耳菊提取物對(duì)CYP3A2表達(dá)的影響是較為復(fù)雜的，并非單純的誘導(dǎo)和抑制作用。以上結(jié)果，提示羊耳菊提取物對(duì)細(xì)胞色素P450酶活性的影響，可能還存在翻譯后修飾機(jī)制。

綜上所述，羊耳菊提取物對(duì)細(xì)胞色素P450酶的影響取決于治療時(shí)間和劑量。羊耳菊在臨床應(yīng)用較廣，與化學(xué)合成藥合用情況較多，可能存在潛在的藥物相互作用。由于羊耳菊對(duì)細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)影響較為復(fù)雜，在臨床上聯(lián)合用藥時(shí)，需要根據(jù)羊耳菊制劑的用量和給藥時(shí)間，來適量增減合用藥物的用量和給藥時(shí)間，確保治療效果和避免由藥物相互作用引起的毒副作用。