楊國(guó)溜 黃建新

癌癥的治療旨在殺除所有惡性細(xì)胞。除了通過(guò)常規(guī)療法使腫瘤細(xì)胞的體積最小化以外,活化的T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力對(duì)于根除腫瘤和治愈癌癥至關(guān)重要。T細(xì)胞衰竭或衰老的特征是多種抑制分子水平升高,效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生受損,增殖能力喪失,細(xì)胞毒性受損以及包括T-bet 在內(nèi)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子用途改變［1-3］。慢性抗原暴露后會(huì)發(fā)生T 細(xì)胞衰竭,從而無(wú)法控制腫瘤擴(kuò)散。在衰竭階段過(guò)度表達(dá)的分子和途徑的調(diào)控可逆轉(zhuǎn)這種功能障礙狀態(tài)并增強(qiáng)免疫反應(yīng)［4,5］。衰老的T細(xì)胞是缺乏CD28 并獲得CD57 和調(diào)節(jié)受體表達(dá)的晚期分化的記憶。表達(dá)CD45RA 而不是CD45RO,都處于細(xì)胞周期停滯期,并增強(qiáng)了炎癥細(xì)胞因子的分泌［6］。研究最多的可作為淋巴細(xì)胞活化負(fù)調(diào)節(jié)劑的抑制分子是CD279(PD-1)和CTLA-4(CD152)。天然殺傷細(xì)胞受體2B4(CD244),糖蛋白CD160,TIM3,Lag3 和許多其他物質(zhì)也已顯示出對(duì)T 細(xì)胞活性調(diào)節(jié)的重要作用［7］。阻斷免疫檢查點(diǎn)分子在實(shí)體癌癥的治療中取得了可喜的成果。然而,針對(duì)這些分子在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究相對(duì)較少［8-10］。最近,關(guān)于骨髓瘤患者的程序性死亡受體1(PD-1)表達(dá)等免疫檢查點(diǎn)的數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表。此外,在體外研究了PD-1 阻斷抗體重新激活患病T 細(xì)胞的潛力,并證明了該分子是免疫療法的有前途的候選藥物［11］。然而,在體內(nèi),這些PD-1 抑制劑似乎僅在骨髓瘤患者中與免疫調(diào)節(jié)藥物聯(lián)用。多發(fā)性骨髓瘤是血液癌癥,其特征是惡性漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)積累。盡管通過(guò)引入新的免疫調(diào)節(jié)劑和蛋白酶體抑制劑在治療上取得了進(jìn)展,但該癌癥仍在很大程度上無(wú)法治愈。通過(guò)觀察同種異體干細(xì)胞移植或輸注供體淋巴細(xì)胞后疾病緩解的情況,強(qiáng)調(diào)了多發(fā)性骨髓瘤的免疫原性。更深入地描述骨髓瘤免疫系統(tǒng)的腫瘤驅(qū)動(dòng)缺陷將有助于新型免疫治療策略的發(fā)展。

1 資料與方法

在本院骨外科的髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中,從年齡匹配的健康供體中采集同一個(gè)體股骨近端的外周血樣本和骨髓抽吸物(12 例),T 細(xì)胞亞群的分布相當(dāng)。對(duì)健康受試者進(jìn)行了病毒感染和骨髓異常篩查,未接受免疫調(diào)節(jié)藥物或未患有已知會(huì)影響免疫系統(tǒng)的疾病,包括自身免疫性疾病或癌癥。外周血單核細(xì)胞(PBMC)和骨髓單核細(xì)胞(BMMC)通過(guò)密度梯度離心犯法進(jìn)行分離,并采取流式細(xì)胞術(shù)分析,冷凍保存以用于以后的功能分析。凍T 細(xì)胞的回收率高于85%。使用熒光標(biāo)記的CD3 抗體(UCHT1),CD4 抗體(RPA-T4),CD8(RPA-T8),CD28 抗體(CD28.2)通過(guò)多色染色在無(wú)紅細(xì)胞樣品(血液樣品和骨髓穿刺液)中進(jìn)行表面抗原染色,CD45(2D1),CD45RA(HI100),CD57(NK-1),CD62L(DREG-56),CD152/CTLA-4(BNI3),CD160(BY55),CD244/2B4(2-69),CD279/PD1(MI-H4)。為了對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)染色,分別用抗CD3(2 μg/ ml)和抗CD28(5 μg/ml)刺激PBMC 和BMMC 6 或24 h。在培養(yǎng)的最后4 h 內(nèi),將10 mg/ml 的布雷菲德菌素A 添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中。使用CytoFix/CytoPerm 試劑盒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。所有抗細(xì)胞因子的抗體(IL-2,IFNγ,B27),T-bet(O4-46)和CD107a(H4A3)。流式細(xì)胞儀在BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀上進(jìn)行,隨后使用FACS DIVA Software 7.0 進(jìn)行分析。對(duì)7-AAD 染色的單個(gè)活細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

通過(guò)多色流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了骨髓瘤患者和健康供體的骨髓和外周血T 細(xì)胞上抑制分子的表達(dá),基本資料見(jiàn)表1。

分析另外兩個(gè)抑制性分子的表達(dá),這些分子被認(rèn)為在T 細(xì)胞調(diào)節(jié)中起作用,即CD160 和2B4。CD160與BTLA 競(jìng)爭(zhēng)與皰疹病毒進(jìn)入介體(HVEM)的結(jié)合,并且已被證明對(duì)TCR 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。2B4 在T 細(xì)胞上的交聯(lián)會(huì)降低增殖,并且2B4 的表達(dá)在衰竭的T 細(xì)胞上會(huì)上調(diào)。分析顯示,CD160 和2B4在骨髓瘤患者的骨髓T 細(xì)胞上均顯著上調(diào),表明局部免疫抑制的程度甚至可能比以前的研究估計(jì)的還要高。見(jiàn)表2。

T 細(xì)胞上PD-1 的表達(dá)被認(rèn)為是骨髓瘤疾病的新型治療靶點(diǎn)。通常在效應(yīng)記憶T 細(xì)胞上均有高水平的PD-1 表達(dá)。同時(shí)分析了不同T 細(xì)胞亞群上的PD-1 水平。在健康者和患者的外周血和骨髓腔室之間,CD4+子集的百分比沒(méi)有明顯變化,而CD8+子集的分布卻發(fā)生了顯著變化。在骨髓瘤骨髓中的CD8+T 細(xì)胞庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了效應(yīng)T 細(xì)胞(CD45RA+CD62L-)的大量積累,并且效應(yīng)記憶T 細(xì)胞(CD45RA-CD62L-)的減少甚至更加明顯。見(jiàn)表3。由于衰老導(dǎo)致T 細(xì)胞增加的趨勢(shì),且發(fā)現(xiàn)在骨髓瘤患者中它會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)。此外,所有T 細(xì)胞亞群中PD-1 的表達(dá)均顯著增加。

表1 所有研究對(duì)象基本資料［n,M(P0,P100)］

表2 各分子的T 細(xì)胞百分比［M(P0,P100),%］

表3 骨髓瘤患者和健康者的骨髓抽吸物和PB 中的T 細(xì)胞亞群分布［M(P25,P75),%］

3 討論

CD3+CD4+和CD3+CD8+T 細(xì)胞在骨髓瘤患者的PB 和BM 中均表現(xiàn)出PD-1 的增強(qiáng)表達(dá),這與最近發(fā)布的數(shù)據(jù)一致［12］。此外還證實(shí)CTLA-4 的表達(dá)增強(qiáng),并且發(fā)現(xiàn)僅局限于骨髓瘤患者的骨髓T 細(xì)胞,通常存在的抑制受體的數(shù)量越高,T 細(xì)胞的消耗越嚴(yán)重。

在本文中,研究了多發(fā)性骨髓瘤中T 細(xì)胞缺陷的性質(zhì),并將我們的發(fā)現(xiàn)與年齡匹配的健康供體樣品進(jìn)行了比較。迄今為止尚未對(duì)骨髓瘤患者和健康者的BM和PB 樣本進(jìn)行過(guò)如此徹底的研究。對(duì)檢查點(diǎn)抑制劑分子PD-1,CTLA-4,CD160 和2B4 表達(dá)的系統(tǒng)和局部變化的研究表明,所有測(cè)試的標(biāo)志物均顯著上調(diào),尤其是在骨髓中。免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)和連接可下調(diào)T細(xì)胞反應(yīng),從而維持自身耐受性。使用單克隆抗體(即抗PD-1)破壞受體與配體的相互作用已經(jīng)在幾種實(shí)體瘤的治療中顯示出了顯著的效果,并且在包括骨髓瘤在內(nèi)的血液系統(tǒng)癌癥領(lǐng)域也正在迅速發(fā)展。一個(gè)主要的障礙是對(duì)腫瘤的微抑制作用,它限制了免疫細(xì)胞抵抗癌癥的作用。再加上骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1 的發(fā)現(xiàn),甚至可以通過(guò)基質(zhì)細(xì)胞接觸來(lái)進(jìn)一步上調(diào)PD-L1,PD-1 途徑已被證明可在部分患者中促進(jìn)這種疾病的侵襲性［13］。盡管體外結(jié)果強(qiáng)烈支持PD-1 抑制是有效的治療方法,但與其他B 細(xì)胞惡性腫瘤相比,這些藥物迄今為止仍無(wú)法在體內(nèi)誘導(dǎo)骨髓瘤的主要反應(yīng)［14］。在這里,腫瘤微環(huán)境成為重要的額外靶標(biāo),正在進(jìn)行的將PD-1 抑制劑與免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合的研究似乎更加成功。來(lái)那度胺已被證明可在骨髓瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)免疫激活變化,并下調(diào)PD-L1 表達(dá)［15］。然而,由于PD-L1表達(dá)本身在骨髓瘤中變化很大,其他檢查點(diǎn)抑制劑可能成為同樣重要的靶標(biāo)。在5T33 鼠骨髓瘤模型中的研究已經(jīng)顯示來(lái)那度胺與其他免疫檢查點(diǎn)(如CTLA-4,LAG-3,TIM-3 及其組合)的阻滯作用相結(jié)合。本研究表明,即使在含免疫調(diào)節(jié)劑(IMiD)的療法后,CTLA-4、2B4 和CD160 的表達(dá)仍然很高,因此可能構(gòu)成其他新的靶標(biāo)。CTLA-4 與免疫刺激受體CD28 競(jìng)爭(zhēng)CD80/CD86蛋白的結(jié)合。因此,CTLA-4 途徑的腫瘤參與可能會(huì)抑制微環(huán)境中的免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)腡 細(xì)胞共刺激。

綜上所述,與周圍T 細(xì)胞相比,骨髓瘤患者骨髓中的外周血T 淋巴細(xì)胞受損更為嚴(yán)重,預(yù)后也較差。