柏偉榮*，楊緒芳，張理興，高如意，吳云

江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（連云港 222001）

《中國藥典》2015年版收載的肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉和管花肉蓯蓉（Cistɑnche tubulosɑ（Schrenk）Wight）的肉質(zhì)莖，是名貴的補益藥材。其中苯乙醇苷類物質(zhì)為肉蓯蓉中主要活性成分，有學者已經(jīng)證實該類成分具有明顯的抗老年癡呆、帕金斯病和心肌缺血等作用[1-2]。管花肉蓯蓉的苯乙醇苷成分較其他肉蓯蓉屬植物含量高，其中以松果菊苷和毛蕊花糖苷最多。研究表明毛蕊花糖苷具有抗氧化、抗炎、降血糖及血脂的藥理功效[3-5]，但是該成分與松果菊苷相比在管花肉蓯蓉中含量偏低，這也導致了提取分離研究主要集中在松果菊苷，較少涉及毛蕊花糖苷[6]。隨著生物科技的發(fā)展，酶作為催化劑在中藥領域的應用越來越多[7]，此次試驗研究了利用一種來源于熱袍菌（Thermotogɑ petrophilɑDSM 13995）的β-葡萄糖苷酶，通過對肉蓯蓉提取物的酶解，使得松果菊苷轉(zhuǎn)化為毛蕊花糖苷來富集制備毛蕊花糖苷。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

管花肉蓯蓉飲片（新疆和田天力沙生藥物開發(fā)有限責任公司）；β-葡萄糖苷酶[8]（南京林業(yè)大學趙林果教授實驗室提供）由極端熱袍菌（Thermotogɑ petrophilɑDSM 13995）中β-葡萄糖苷酶基因（Tpebgl3）克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109（DE3）宿主菌表達得到；松果菊苷（自制，純度＞97.4%，采用HPLC測定）；毛蕊花糖苷（批號：11530-201713，92.5%，中國食品藥品檢定研究院）；95%乙醇（食用級，連云港長和酒業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純（美國天地公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

IKA磁力攪拌器；pH計（Mettler-Toledo FE20）；Agilent1100高效液相色譜儀；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Burker-AV-400型核磁共振波譜儀；AE240電子分析天平（瑞士 Mettler公司）。

2 方法

2.1 松果菊苷酶解率的測定

2.1.1 色譜條件[9]

Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫（0～15 min，18%～28% A；15～30 min，28%～32%A；30～40 min，32% A；40～50 min，32%～50% A）；柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；檢測波長330 nm。

2.1.2 線性關系的考察

精密稱取5.0 mg毛蕊花糖苷對照品置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取0.2，0.5，1.0，2.0和3.0 mL該溶液，分別置于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度3.7，9.25，18.5，37和55.5 μg/mL的毛蕊花糖苷溶液，在2.1.1小節(jié)色譜條件下精密吸取10 μL注入色譜儀進行測定，以對照品濃度為橫坐標，以峰面積分值為縱坐標，回歸方程為Y=18 245.572+3 325 654.092X，R=0.999 9。

2.1.3 酶解率的測定

準確稱取1 g松果菊苷，置于500 mL三角瓶中，平行制備2份樣品，加入到399.8 mL緩沖溶液（用醋酸鈉和0.5 mol·L-1的醋酸配制，pH 5.5）中，攪拌均勻，水浴加熱至85 ℃時再加入0.2 mLβ-葡萄糖苷酶溶液，反應4 h后，加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應，將反應終止的酶解液補至400 mL，取1 mL稀釋100倍，在2.1.1小節(jié)的色譜條件下精密吸取10 μL注入色譜儀進行測定，根據(jù)式（1）計算酶解率：

式中：C為毛蕊花糖苷濃度，μg·mL-1；Me為松果菊苷相對分子量，g；Mg為毛蕊花糖苷相對分子質(zhì)量。

2.1.4 毛蕊花糖苷的純化

反應液冷卻后，通過AB-8樹脂富集，95%乙醇洗脫后濃縮干燥，得到高純度的毛蕊花糖苷，按2.1.1小節(jié)的色譜條件采用歸一化法測定毛蕊花糖苷的純度。

2.1.5 溫度對酶解率的影響

稱取6份1.0 g的松果菊苷于6個500 mL三角瓶中，各加入399.8 mL pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，然后各加0.2 mL酶，分別在70，75，80，85，90和95 ℃下反應4 h，然后加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應。按2.1.3小節(jié)測定酶解率。

2.1.6 pH對酶解率的影響

稱取6份1.0 g的松果菊苷于6個500 mL三角瓶中，各加入399.8 mL pH 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0和6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，然后各加0.2 mL酶，分別在85℃下反應4 h，之后再加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應。按2.1.3小節(jié)測定酶解率。

2.1.7 加酶量對酶解率的影響

稱取6份1.0 g的松果菊苷分別于6個500 mL三角瓶中，各加入400，399.95，399.9，399.8，399.6和399.0 mL pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，再分別加入0，0.05，0.1，0.2，0.4和1.0 mL酶液，于85 ℃酶解4 h，加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應。按2.1.3小節(jié)測定酶解率。

2.1.8 酶解時間對酶解率的影響

稱取6份1.0 g的松果菊苷于6個500 mL三角瓶中，各加入399.8 mL pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，然后各加0.2 mL酶，于85 ℃分別酶解0.5，1，2，3，4和6 h，加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應。按2.1.3小節(jié)測定酶解率。

2.2 毛蕊花糖苷的結構鑒定

使用Burker生產(chǎn)的AV-400型核磁共振波譜儀，采用核磁共振氫譜（1H-NMR）法和核磁共振碳譜（13C-NMR）法鑒定毛蕊花糖苷結構。

2.3 利用酶轉(zhuǎn)化管花肉蓯蓉提取物

管花肉蓯蓉提取物，為管花肉蓯蓉經(jīng)過水提，水提液再經(jīng)過AB-8大孔樹脂富集所得到的提取物。稱取2.5 g肉蓯蓉提取物，加入到399.8 mL緩沖溶液（用醋酸鈉和0.5 mol·L-1的醋酸配制，pH 5.5）中，攪拌均勻，水浴加熱至85 ℃時再加入0.2 mLβ-葡萄糖苷酶溶液，反應4 h，加入20 mL 1 mol·L-1Na2CO3溶液終止反應。按2.1.1小節(jié)色譜條件進行含量測定。

反應液冷卻后，通過AB-8樹脂富集，95%乙醇洗脫后濃縮干燥，得到高純度的毛蕊花糖苷，按2.1.1小節(jié)的色譜條件采用歸一化法測定毛蕊花糖苷的純度。

3 結果與討論

3.1 松果菊苷酶解率的測定結果

圖1 松果菊苷和毛蕊花糖苷的HPLC圖

通過HPLC對酶解得到的毛蕊花糖苷進行檢測，酶解率為95.6%；經(jīng)過分離純化，測得毛蕊花糖苷樣品純度在96%以上，結果如圖1所示。

3.2 溫度對酶解率的影響

因為酶是蛋白質(zhì)，高溫會使蛋白質(zhì)變性失去活性，所以高溫會影響酶的作用和活性，低溫也會抑制酶活性。由圖2可知，當溫度為85 ℃時酶解率最高，即β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為85 ℃。

圖2 溫度對酶解率的影響

3.3 pH對酶解率的影響

過酸、過堿能使酶本身變性失活，因此有必要考察緩沖液pH對酶解率的影響。由圖3可知，當pH為5.5時，酶解率最高；當pH低于或高于5.5時，酶活性明顯降低。即β-葡萄糖苷酶的最適反應pH為5.5。

圖3 pH對酶解率的影響

3.4 加酶量對酶解率的影響

考察加酶量對酶解率的影響，以加酶量為橫坐標，酶解率為縱坐標作圖，加酶量對酶解率的影響見圖4。在較低的酶濃度下，隨著β-葡萄糖苷酶酶量的增加，松果菊苷的酶解率逐漸增加，當加酶量達到0.2 mL時增長的趨勢變緩，所以當?shù)孜锼晒哲諡? g時，最適加酶量為0.2 mL。

3.5 酶解時間對酶解率的影響

當加酶量為m（松果菊苷）︰V（酶液）=1 g︰0.2 mL時，考察最適酶解時間。由圖5可知，4 h時酶解率為95%，幾乎完全酶解；4 h后基本完全反應，酶解率增加得非常緩慢。所以，當加酶量為m（松果菊苷）︰V（酶液）=1︰0.2（g/mL），pH為5.5，溫度為85 ℃時，最適酶解時間為4 h。

綜上所述，利用耐熱β-葡萄糖苷酶酶解松果菊苷轉(zhuǎn)化為毛蕊花糖苷的最適反應條件為：每克松果菊苷加入0.2 mL的酶液，溫度85 ℃，pH 5.5，反應時間4 h。

圖4 加酶量對酶解率的影響

圖5 酶解時間對酶解率的影響

3.6 酶解得到的毛蕊花糖苷的結構鑒定

利用核磁共振波譜對酶解產(chǎn)物進行結構檢測。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.06（1H，d，J=1.8 Hz），6.96（1H，dd，J=1.8 Hz，8.0 Hz），6.78（1H，d，J=8.0 Hz），6.70（1H，d，J=1.8 Hz），6.68（1H，d，J=8.0 Hz），6.57（1H，dd，J=1.8 Hz，8.0 Hz），7.60（1H，d，J=16.0 Hz），6.28（1H，d，J=16.0 Hz），5.19（1H，d，J=0.7 Hz），4.37（1H，d，J=8.0 Hz），2.79（1H，t）。13C-NMR（101 MHz，CD3OD）δ：167.04，148.37，146.73，145.39，144.68，143.23，130.17，126.30，121.97，120.01，115.84，115.25，115.05，113.97，113.34，102.75，101.66，80.38，74.78，74.54，72.42，70.96，70.90，70.68，69.21，69.07，60.97，57.04，35.15，17.14。以上數(shù)據(jù)與文獻[10-11]報道的毛蕊花糖苷一致，故確定酶解所得化合物為毛蕊花糖苷。

3.7 酶水解管花肉蓯蓉提取物的測定結果

利用2.1.1小節(jié)的液相方法，通過HPLC對管花肉蓯蓉提取物進行檢測。經(jīng)檢測，肉蓯蓉提取物中松果菊苷含量占38.7%，毛蕊花糖苷含量僅為1.9%，毛蕊花糖苷的含量在管花肉蓯蓉提取物中含量偏低。

利用該酶對管花肉蓯蓉提取物進行酶解，以富集制備毛蕊花糖苷。通過液相檢測反應液的松果菊苷以及毛蕊花糖苷的含量，結果顯示4 h后，松果菊苷全部轉(zhuǎn)化為毛蕊花糖苷，含量約32.1%；取反應終止液進行純化，得到0.48 g毛蕊花糖苷樣品，毛蕊花糖苷含量為64.3%。

圖6 管花肉蓯蓉提取物（上）及酶解液（下）的HPLC圖

4 討論與結論

管花肉蓯蓉的主要活性成分是以松果菊苷和毛蕊花糖苷為代表的苯乙醇苷類物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷具有消炎、抗氧化、降低Ⅱ型糖尿病小鼠血糖血脂等藥理功效[3,5,12-15]；還有研究表明毛蕊花糖苷具有雄性激素的作用，為肉蓯蓉補腎壯陽的重要活性成分[16]。但是管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的含量偏低，此次試驗利用轉(zhuǎn)基因技術得到的一種耐熱的β-葡萄糖苷酶，通過轉(zhuǎn)化肉蓯蓉提取物中的松果菊苷，使其轉(zhuǎn)化為毛蕊花糖苷，極大地提高了毛蕊花糖苷的含量。該酶催化松果菊苷水解的最適反應溫度為85 ℃，最適pH為5.5，當2.5 g肉蓯蓉提取物加0.2 mL酶液時，反應4 h，松果菊苷基本完全轉(zhuǎn)化為毛蕊花糖苷。由于管花肉蓯蓉提取物中還有很多含有β-葡萄糖結構的化合物比如管花苷A、B、C等，因此管花肉蓯蓉提取液通過該酶反應后，不僅松果菊苷轉(zhuǎn)化為毛蕊花糖苷，還有其他成分一同轉(zhuǎn)化，進一步研究可以考慮研究酶解后肉蓯蓉的化學成分。

因為β-葡萄糖苷酶具有極耐熱性，在后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)中，管花肉蓯蓉提取后，提取液未經(jīng)冷卻可直接加入酶水解轉(zhuǎn)化，操作簡單便捷，易于工業(yè)化生產(chǎn)，有良好的應用前景。