許俊齊，謝春芹*，王瑞，黃小忠，張雪松，宋金俤

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院茶與食品科技學院（句容 212400）

近幾年中國的精釀啤酒呈現(xiàn)出快速發(fā)展的趨勢，以多元化、個性化、高端化為特點的精釀啤酒得到大眾的青睞，口味單一、寡淡口味的傳統(tǒng)啤酒不能滿足消費需求。中國精釀啤酒的市場份額約占整個啤酒市場的1%，其發(fā)展空間巨大[1]。隨著消費者對健康和飲食品質(zhì)要求的不斷提高，多樣的口味、健康的品質(zhì)要求都需推陳出新精釀啤酒的出現(xiàn)[2]。

桑黃菌（Phellinus linteus）又稱桑耳，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）、多孔菌科、木層孔菌屬（Phellinus）真菌，因通常生長在桑屬植物上，子實體顏色鮮黃而得名，是多年生的珍稀藥用真菌，有“森林黃金”之美稱[3-4]。

近年來國內(nèi)外學者對桑黃的藥理作用及化學成分等方面的深入研究表明桑黃具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗血管生成和抗氧化等多種生理活性[5-7]。由于桑黃特殊的生物特性及外界環(huán)境要求苛刻，野生桑黃數(shù)量非常稀少，加上人工栽培難度大、周期長，無法滿足人們對珍稀桑黃資源的廣泛需求，這嚴重限制了桑黃應(yīng)用。桑黃菌人工發(fā)酵培養(yǎng)獲取桑黃菌絲體為其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供可能，且生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)和環(huán)境的限制，發(fā)酵所得菌絲體多糖與子實體多糖功效相當。

試驗將桑黃菌絲液與麥芽汁進行有機結(jié)合，不但具有精釀啤酒的諸多特性，也賦予桑黃菌絲多種功效。通過模糊數(shù)學評價法對精釀啤酒進行數(shù)學化和定量化的描述和處理，減少人為主觀判斷的影響，使評價結(jié)果更為科學[8-9]，為此類精釀產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)提供借鑒及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃菌種（江蘇食用菌研究所）；纖維素酶（食品級，南京松冠生物技術(shù)有限公司）；食品級大麥芽（粵海永順泰（寧波）麥芽有限公司）；食品級顆粒酒花哇卡圖（Waktu，山東淄博瑞源生物有限公司）；WB06酵母（法國弗曼迪斯）；啤酒糖漿（青州市華康生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DBS304-01-30L保溫糖化桶（煙臺帝伯仕自釀酒有限公司）；ZM30L立式自控發(fā)酵罐（濟南正麥機械設(shè)備有限公司）；WNY-11BF電子溫度計（煙臺帝伯仕自釀酒有限公司）；DBS-20M濾網(wǎng)（煙臺帝伯仕自釀酒有限公司）；WY090R手持折光儀（上海淋譽貿(mào)易有限公司）；TMACS-02B分析天平（凱豐集團有限公司）；LHS-150SC型低溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；JMF-3A粉碎機（上海鑫泰機電（集團）有限公司）；SPL-250生化培養(yǎng)箱（天津萊玻特瑞儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 麥芽汁的制備

大麥芽放入容器中加入約麥芽質(zhì)量5%的水，濕潤表面10 min，使麥麩變軟，用粉碎機粉碎，使麩皮“破而不碎”，麥芽粗細粉比例1︰2.5。

1.3.2.2 麥芽的糖化

參照楊永學等[10]的糖化方法，按料水比1︰4.5（g/mL），在62 ℃條件下保溫50 min，后邊攪拌邊升溫至78 ℃，保持30 min，攪拌升溫至78 ℃，保溫10 min，碘檢至糖化完全。

1.3.2.3 麥醪過濾

糖化完成后，采用濾槽法進行過濾，要求麥汁清亮和麥汁數(shù)量多，固形物含量小于30 mg/L。

1.3.2.4 桑黃菌絲液制備

將桑黃菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，進行斜面培養(yǎng)；將桑黃菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中，進行一級搖瓶培養(yǎng)，控制轉(zhuǎn)速190 r/min，28 ℃下培養(yǎng)，15 d后收集菌絲懸液。斜面培養(yǎng)基組成組分為：葡萄糖20 g/L，玉米粉20 g/L，蛋白胨1 g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO4

2 g/L，瓊脂20 g/L。

將經(jīng)過一級搖瓶培養(yǎng)桑黃菌種的接種到搖瓶培養(yǎng)基中進行二級搖瓶培養(yǎng)?？刂茥l件如一級搖瓶培養(yǎng)。將生產(chǎn)搖瓶二級種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行擴大培養(yǎng)，得到一級桑黃菌種；一級搖瓶培養(yǎng)條件為接入經(jīng)過斜面培養(yǎng)的桑黃菌種1.5～2.0 cm2，以轉(zhuǎn)速150～200 r/min，在20～30 ℃條件下，振蕩培養(yǎng)7～8 d。

將一級桑黃菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)7 d，發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15 g/L，玉米粉25 g/L，蛋白胨0.5 g/L，麩皮5 g/L，KH2PO42 g/L，Mg SO40.5 g/L。將過濾后的桑黃菌絲，置于60±1 ℃烘干至恒重，粉碎后過30目篩，加入質(zhì)量百分數(shù)為0.7%～1.0%纖維素酶溶液中，在50～60 ℃條件下酶解2～4 h，溶液pH 6.0～6.5，桑黃菌絲與纖維素酶溶液料液比1︰10～1︰15（g/mL），即得桑黃菌絲液。

1.3.2.5 煮沸與酒花的添加

參照楊婧娀[11]的方法。麥芽汁煮沸前添加11%桑黃菌絲液及0.5%啤酒糖漿，煮制期間麥汁保持沸騰狀態(tài)，分兩次添加酒花，煮沸10 min添加0.10%酒花，煮沸結(jié)束10 min前添加酒花的1/3，即0.05%[10]。

1.3.2.6 回旋沉淀

煮沸結(jié)束的麥汁進入回旋沉淀槽中，靜置20 min分離出熱凝固物，糖度計測定麥芽汁濃度，澄清的麥汁進入板式冷卻器中冷卻到10 ℃以下，導入發(fā)酵罐中[12-13]。

1.3.2.7 主發(fā)酵及二次發(fā)酵

參照洪涵煜等[14]及周廣田[15]方法向發(fā)酵罐加入已活化的酵母，接種量0.4～0.6 g/L，在恒溫18 ℃密封的環(huán)境下進行發(fā)酵。發(fā)酵期間，當發(fā)酵液殘?zhí)遣粶p、比重恒定時，結(jié)束主發(fā)酵。二次發(fā)酵轉(zhuǎn)入密封罐，加入適量啤酒糖漿，室溫放置5～7 d。移至低溫4 ℃貯藏。

1.3.3 單因素試驗

采用單因素變量控制法進行單因素試驗，以表2感官評定標準為參考依據(jù)，研究桑黃菌絲液添加量（5%，7%，9%，11%，13%和15%）、酒花添加量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%）及原麥汁濃度（9，11，13，15，17和19 °P）對桑黃精釀啤酒外觀、口味、泡沫及香氣等感官綜合評分的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以桑黃菌絲液、原麥汁濃度、酒花的添加量為變因，采用四因素三水平L9(34)正交試驗設(shè)計方案，以模糊數(shù)學評判方法為基準，并根據(jù)感官評定結(jié)果計算感官綜合評分，優(yōu)化其發(fā)酵工藝參數(shù)。桑黃啤酒發(fā)酵工藝L9(34)正交試驗因素與水平見表1。

表1 桑黃啤酒發(fā)酵工藝L9(34)正交試驗因素和水平

1.3.5 桑黃啤酒模糊感官評定方法

參考GB/T 394.2—2008[16]及GB/T 16291.1—2012[17]，挑選10位經(jīng)過培訓的品評員（男士5位，女士5位）組成評價小組，要求所有待評啤酒樣品均以透明玻璃杯盛裝，隨機取樣，評定啤酒樣品后要漱口，間隔單位為10 min。

1.3.5.1 模糊數(shù)學模型的建立

以桑黃啤酒的外觀、口味、泡沫、香氣為因素集U，以優(yōu)、良、差為評語集V，根據(jù)感官評定結(jié)果，建立4個單因素評價矩陣，采用模糊數(shù)學法對其進行分析[18]。

1.3.5.2 確定產(chǎn)品因素集U和評語集V

確定桑黃啤酒的產(chǎn)品質(zhì)量由色澤、組織形態(tài)、滋味、香氣4個因素構(gòu)成，即U=（外觀，口味，泡沫，香氣）；對每個因素的評價按優(yōu)、良、差3個等級評定，即V={優(yōu)（V1），良（V2），差（V3）}[19]。

1.3.5.3 確定權(quán)重

試驗采用調(diào)查法確定色澤、組織形態(tài)、滋味、香氣各因素的權(quán)重[19]。確定各質(zhì)量因素的權(quán)重分別為外觀（0.3）、口味（0.2）、泡沫（0.3）、香氣（0.2），即X=（0.3，0.2，0.3，0.2）。

1.3.5.4 模糊綜合評判總分

模糊關(guān)系綜合評判集Y=X×R，其中X為權(quán)重集，R為模糊矩陣[21]。設(shè)定感官特殊性：優(yōu)為90分，良為70分，差為50分，可建立感官特殊性數(shù)集Z=（90，70，50），則樣品的模糊綜合評判總分為T=Y×Z[22]。

表2 感官評定標準

1.3.6 桑黃啤酒產(chǎn)品微生物及理化指標的測定

參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[16]中相關(guān)規(guī)定進行檢測總酸、雙乙酰、酒精度等。

采用GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》[23]中的計數(shù)法，對大腸桿菌進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃菌絲液添加量對于啤酒感官綜合評價的影響

桑黃菌絲液添加量對啤酒感官評分的影響，見圖1。隨著桑黃菌絲液添加量增加啤酒的感官評分呈現(xiàn)先增大再減少趨勢。桑黃菌絲液添加量11%時，感官評分值達到最高81.7分。菌絲液含量低于11%時，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香味不足，啤酒口味過于單薄，故評分較低。過多添加桑黃菌絲液時，進一步改變啤酒的麥芽香和酒花香，使得感官評分降低。

圖1 菌絲液添加量對啤酒感官評分的影響

2.2 原麥汁濃度對桑黃精釀啤酒感官綜合評分的影響

由圖2分析可知，原麥汁濃度13 °P時，口感最佳，啤酒口感清爽，酒體協(xié)調(diào)，感官評分最高達79.6分，麥香、酒花等香氣協(xié)調(diào)，口感醇厚。原麥汁濃度大于13 °P，感官評分減小，原因在于較高的麥汁濃度，使得酵母的整體活力和發(fā)酵性能發(fā)生相應(yīng)變化，酵母代謝產(chǎn)生的香味物質(zhì)也發(fā)生變化，最終影響酒體的整體感官評分。故分析認為，桑黃精釀啤酒的最佳原麥汁濃度為13 °P。

2.3 酒花添加量桑黃精釀啤酒感官綜合評分的影響

酒花可賦予啤酒良好的口感，使得酒體中香氣更加豐富，口感層次感強、更佳飽滿，但添加量過多或過少將對啤酒感官評分產(chǎn)生不良影響。由圖3分析得出，酒花添加量小于0.15%時，體現(xiàn)不出啤酒的風味，口感較淡，酒花添加量大于0.15%時，啤酒苦味嚴重，消費者難以接受，感官評分較低。酒花添加量0.15%時，感官分值達82.8分，由于其他添加比例，啤酒口味純正，有愉快的復(fù)合酒香氣，苦味也較適合，爽口，酒體協(xié)調(diào)，無明顯異味。

圖2 原麥汁濃度對啤酒感官評分的影響

圖3 酒花添加量對啤酒感官評分的影響

2.4 正交試驗數(shù)學模糊評判結(jié)果

由表3可知，10名感官評定員對桑黃菌絲液啤酒的感官評價結(jié)果并不集中并且存在差異。

表3 桑黃菌絲液啤酒的感官評定結(jié)果

2.5 模糊矩陣的建立

以表4的1號樣品為例，外觀評價結(jié)果有2人選優(yōu)，2人選良，6人選差，則R色澤=（0.2，0.2，0.6）、則R口味=（0.1，0.2，0.7）、R泡沫=（0.1，0.4，0.6）、R香氣=（0.1，0.2，0.7）。

將4種評價結(jié)果寫成矩陣形式，如：

根據(jù)模糊變換的原理，按照Y=X×R，其中X為權(quán)重集，R為模糊矩陣。對1～9號樣品進行綜合模糊評判，結(jié)果為：Y1=（0.13，0.26，0.64）；Y2=（0.25，0.41，0.34）；Y3=（0.28，0.45，0.27）；Y4=（0.60，0.35，0.05）；Y5=（0.79，0.19，0.02）；Y6=（0.38，0.53，0.09）；Y7=（0.30，0.58，0.12）；Y8=（0.21，0.27，0.52）；Y9=（0.18，0.36，0.46）。

2.6 桑黃精釀啤酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化

從表4桑黃菌絲精釀啤酒最佳發(fā)酵工藝的正交試驗結(jié)果中的R值可知，影響其感官評分的因素主次順序為A＞C＞B，即桑黃菌絲液＞酒花＞原麥汁濃度。依據(jù)綜合評分的結(jié)果分析可知，優(yōu)化的工藝組合為A2B2C3，即11%桑黃菌絲液，原麥汁濃度13 °P，0.20%的酒花添加量，制得的桑黃精釀啤酒外觀、口感、風味及香味的綜合值均保持在最高。

表4 桑黃菌絲液精釀啤酒發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果

對試驗結(jié)果進行方差分析，表5數(shù)據(jù)顯示，在試驗條件下，桑黃菌絲液添加量與酒花添加量對猴頭菇啤酒的綜合感官評分影響顯著（p＜0.05）。

表5 發(fā)酵工藝方差分析

2.7 擴大性驗證試驗

獲得的優(yōu)化方案A2B2C3為試驗第5組試驗，為進一步確認其在實際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，以其為條件（桑黃菌絲液11%，原麥汁濃度13 °P，酒花添加量0.20%），進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復(fù)3次，經(jīng)品評后，綜合得分達87.3±0.5分，試驗結(jié)果均優(yōu)于正交試驗的9組試驗組，表明該配方為較佳的桑黃菌絲啤酒的最佳發(fā)酵條件。

2.8 桑黃菌絲啤酒理化、衛(wèi)生指標

由表6分析得出，桑黃菌絲精釀啤酒中的各項指標符合GB 4927—2008《啤酒》中特種啤酒質(zhì)量要求。此外檢測表明，大腸菌群MPN小于3 CFU/100 mL。桑黃啤酒具有酒液清亮透明、泡沫細膩、略黃、掛杯持久、口感無異味等特點，且伴有淡淡的麥芽香以及酒花香。

表6 桑黃精釀啤酒理化指標檢測結(jié)果

3 結(jié)論

采用單因素變量控制法，結(jié)合感官綜合評分確定桑黃菌絲液、原麥汁濃度及酒花添加量3個因素最優(yōu)控制量。在此基礎(chǔ)上，通過正交試驗及模糊數(shù)學綜合評判的方法，在減少的主觀影響因素的同時，通過確定權(quán)重、計算模糊評價分值來比較試驗樣品之間的感官差別，優(yōu)化桑黃菌絲液精釀啤酒發(fā)酵的工藝參數(shù)。結(jié)果表明，桑黃菌絲液添加量11%，原麥汁濃度控制在13 °P，酒花添加量0.20%，感官綜合得分為87.3分。此方法制得的精釀啤酒在保留桑黃功效成分的同時，其特點為酒體清亮淡褐色，酒花香味濃，泡沫細膩，持泡性強，口感協(xié)調(diào)，無異香異味。

試驗為精釀啤酒的感官評價提供模糊評判的理論參考，也豐富精釀啤酒的種類，為其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供借鑒作用。