李秀鑫，吳紅艷*，于曉丹，翟麗萍

1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）；2. 山東星光糖業(yè)有限公司（德州 253000）

葉黃素屬于一種存在于天然環(huán)境中的無(wú)維生素A活性的類胡蘿卜素[1-2]，是一種含有兩個(gè)不同紫羅酮環(huán)的天然黃體素，是存在于人體視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的主要色素[3-5]。在自然界中的各類果蔬、花卉中均有大量存在。可作為天然著色劑用于各行業(yè)生產(chǎn)，并由于其具有寶貴的生物活性，抗氧化性，可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用，對(duì)預(yù)防和治療老年性黃斑退化綜合癥、心血管疾病和機(jī)體免疫力等疾病方面有明顯功效[6-8]。葉黃素現(xiàn)已在各類健康產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位，是一種不可或缺的組成。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于葉黃素的生產(chǎn)與應(yīng)用均已得到一定成果，如申雪然等[9]研究葉黃素在嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)過(guò)程和貨架期的損失率，分析影響葉黃素穩(wěn)定性的各項(xiàng)因素。趙永平等[10]研究超臨界CO2法萃取萬(wàn)壽菊中葉黃素的最佳工藝條件，萃取量最高可達(dá)0.436 mg/g。但在葉黃素的提取及應(yīng)用過(guò)程中，需要不同工藝手段進(jìn)行操作收集，可能會(huì)出現(xiàn)提取率較高，但是保存條件較差，致使葉黃素凈得率與應(yīng)用率反而低于其他工藝條件，不能達(dá)到預(yù)期效果。試驗(yàn)旨在探索葉黃素最佳保存條件，為葉黃素的保存與制備提供便利，對(duì)葉黃素的生產(chǎn)與應(yīng)用領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料、試劑

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器和設(shè)備

BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DL-360E智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；SHZ-C水浴恒溫振蕩器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PB-10型酸度計(jì)（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 波長(zhǎng)的選擇

準(zhǔn)確稱取10 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，利用超聲使其進(jìn)行更好溶解，利用分光光度計(jì)在400～600 nm處測(cè)其吸光度[11]，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制其葉黃素吸收光譜曲線，測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取3.33 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，利用超聲使其更好的互溶，配制成0.033 mg/mL的乙醇-葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，從其中分別吸取1.25，2.50，5.00，7.50和10.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用無(wú)水乙醇定容至25 mL棕色容量瓶中，其葉黃素的梯度質(zhì)量濃度為0.001 65，0.003 30，0.004 95，0.006 60和0.008 25 mg/mL。在其最大吸收峰處測(cè)其吸光度，繪制其葉黃素-乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 葉黃素穩(wěn)定性的研究

準(zhǔn)確稱取10 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶于3 000 mL無(wú)水乙醇中，研究溫度、加熱時(shí)間及pH在其最大吸收波長(zhǎng)處對(duì)葉黃素穩(wěn)定性的影響，并進(jìn)行正交試驗(yàn)。

式中：n為葉黃素含量，mg；C為葉黃素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為葉黃素-乙醇溶液體積，mL。

式中：A1為在不同條件下的葉黃素含量；A為葉黃素溶于無(wú)水乙醇中含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，通過(guò)Origin 8.0軟件繪圖，正交設(shè)計(jì)助手軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長(zhǎng)的選擇

將葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶于無(wú)水乙醇中，在400～600 nm的范圍內(nèi)測(cè)其吸光度，繪制葉黃素吸收光譜曲線，如圖1所示。

葉黃素在波長(zhǎng)447 nm處時(shí)有其最大吸收峰，因此測(cè)定吸光度時(shí)，波長(zhǎng)選447 nm。

圖1 葉黃素吸收光譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置梯度濃度的葉黃素-乙醇溶液，在其最大吸收波長(zhǎng)（447 nm）處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

由圖2可知，葉黃素-乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=27.212x-0.014 7，R2=0.997。由此可知，葉黃素在447 nm處的吸光度與葉黃素的濃度線性關(guān)系良好，可用于葉黃素的定量分析。

圖2 葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 溫度對(duì)葉黃素穩(wěn)定性的影響

取25 mL pH 8的葉黃素-乙醇溶液分別置于20～100℃恒溫水浴振蕩器中2 h，在447 nm處測(cè)其吸光度，并計(jì)算其含量及保存率。如圖3所示。

由圖3可知，葉黃素在溫度20～100 ℃，2 h條件下，葉黃素含量和保存率隨著溫度增加而降低，60 ℃時(shí)保存率為96.5%，而在100 ℃時(shí)葉黃素的保存率僅67%，說(shuō)明葉黃素在常溫下具有較高的保存率，高溫條件下葉黃素較不穩(wěn)定，溫度高于60 ℃時(shí)葉黃素的穩(wěn)定性急速下降，損失較多。因此，為在葉黃素的生產(chǎn)及應(yīng)用中達(dá)到良好效果，其加熱溫度應(yīng)不超過(guò)60 ℃。

圖3 溫度對(duì)葉黃素穩(wěn)定性的影響

2.4 加熱時(shí)間對(duì)葉黃素穩(wěn)定的影響

取25 mL pH 8的葉黃素-乙醇溶液置于60 ℃的恒溫水浴振蕩器中，振蕩0～3 h，在447 nm處測(cè)其吸光度，并計(jì)算其含量及保存率。如圖4所示。

由圖4可知，葉黃素在60 ℃，不同時(shí)間的條件下，隨著加熱時(shí)間增加，葉黃素含量及保存率降低，加熱時(shí)間超過(guò)2 h，葉黃素的保存率急劇下降，說(shuō)明加熱時(shí)間越長(zhǎng)，葉黃素的穩(wěn)定性越差。故葉黃素在制備應(yīng)用中，加熱時(shí)間應(yīng)不超過(guò)2 h。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)葉黃素穩(wěn)定性的影響

2.5 pH對(duì)葉黃素穩(wěn)定性的影響

取25 mL pH 1～14的葉黃素-乙醇溶液置于恒溫水浴振蕩器中，在60 ℃、2 h條件下，在447 nm處測(cè)其吸光度，并計(jì)算其含量及保存率。如圖5所示。

由圖5可知，葉黃素含量及保存率隨著pH增加而增加，在趨于平穩(wěn)，最后增加。pH 1～4時(shí)，其葉黃素含量和保存率較低，由于酸性過(guò)強(qiáng)，葉黃素被氧化，因此葉黃素的保存率較低，pH 5～13時(shí)，含量及保存率基本保持不變。但pH 14時(shí)，葉黃素含量增加，由于強(qiáng)堿性條件下葉黃素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有固體析出，因此含量升高。由于葉黃素-乙醇溶液接近pH 8，因此試驗(yàn)選擇pH 8。

圖5 pH對(duì)葉黃素穩(wěn)定性的影響

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇溫度、加熱時(shí)間和pH 3個(gè)因素，并測(cè)定其吸光度，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，因子水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

由表2可以得出，不同因素對(duì)葉黃素的影響順序依次為溫度＞加熱時(shí)間＞pH，通過(guò)K值可知，其最佳條件為A2B2C1，且溫度具有顯著性。因此在葉黃素的生產(chǎn)及應(yīng)用中應(yīng)注意反應(yīng)pH處于5～13之間，pH 7最佳；加熱時(shí)間不宜超過(guò)2 h；溫度不宜超過(guò)80 ℃。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，其在試驗(yàn)生產(chǎn)中溫度80 ℃，加熱時(shí)間2 h，pH 7時(shí)葉黃素的穩(wěn)定性最佳，保存率最高。

表2 葉黃素穩(wěn)定性L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論

葉黃素是一種功能性較強(qiáng)的色素，在食品添加劑中有著重要的地位，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。經(jīng)試驗(yàn)所得：葉黃素在447 nm處有最大吸收峰；在加熱溫度60℃時(shí)葉黃素的保存率為96.5%，而在100 ℃時(shí)葉黃素保存率僅67%，說(shuō)明葉黃素在高溫條件下不穩(wěn)定；pH 1～4時(shí)葉黃素被氧化，其含量和保存率較低，pH 5～13范圍內(nèi)，其含量基本不變，葉黃素的穩(wěn)定性較好，pH 14（強(qiáng)堿條件）時(shí)，葉黃素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，容易被氧化；經(jīng)正交試驗(yàn)表明，葉黃素穩(wěn)定性的影響因素依次為溫度＞加熱時(shí)間＞pH，其中加熱溫度對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性影響最大，pH對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性的影響最小。溫度80 ℃，加熱時(shí)間2 h，pH 7時(shí)葉黃素的穩(wěn)定性最好，保存率最高。試驗(yàn)為葉黃素的保存與制備提供便利，對(duì)葉黃素的生產(chǎn)與應(yīng)用領(lǐng)域提供有效的理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。