蘇志堅(jiān) 黃智鋒 楊成梓 陳 鳴 唐金模 陳雪梅 彭連共

梔子根為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥根，亦稱梔子花根，主產(chǎn)于湖南、浙江、福建、江西等省。民間別稱山里黃根、黃枝根、山枝根、三枝根等?！吨腥A本草》載：“梔子根主治黃疸型肝炎、痢疾、膽囊炎、感冒高熱、吐血、衄血、尿路感染，尚可用于治療腎炎水腫、乳腺炎、風(fēng)火牙痛、瘡癰腫毒、跌打損傷等”[1,2]。民間廣泛用于黃疸性肝炎、感冒高熱、出血吐血等病癥的治療。梔子根在我院使用較為廣泛，在我院肝病中心臨床診療中得到了較為充分的應(yīng)用，是肝病中心的特色用藥，其療效得到了充分的肯定，同時有著較長的用藥歷史。目前藥材市場上供應(yīng)的梔子根多混有部分莖、枝部位，時而出現(xiàn)混有較高比例莖、枝的藥材，且該現(xiàn)象較為普遍。本研究擬對梔子根、莖、枝不同部位的抗肝炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理活性指標(biāo)成分齊墩果酸開展研究，為規(guī)范梔子根的藥用部位，是否拓寬梔子根藥用部位，確保梔子根藥材質(zhì)量提供一定的客觀依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-20AT高效液相色譜分析儀(日本島津公司)； Platisil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)； BSA224S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥對照品：齊墩果酸購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司(批號 ZZS18031601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)。試劑：甲醇(色譜級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(色譜級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；水為超純水。藥材：梔子根樣品采集自福建廈門、泉州、漳州、寧德等地海拔約60～500 m的野生梔子，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室楊成梓教授鑒定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥根，此外，還收集了梔子莖、梔子枝等梔子不同部位樣品，除去雜質(zhì)，洗凈，切片后干燥，粉碎后過三號篩。以上樣品均保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥科研實(shí)驗(yàn)室。梔子根、莖、枝樣品信息詳見表1。

表1 梔子根、莖、枝樣品信息表

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 以齊墩果酸為參照指標(biāo)的薄層色譜鑒別精密稱取過三號篩的各種樣品粉末1 g，放置帶塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入4%的鹽酸甲醇溶液50 ml，稱定重量，加熱回流4 h，放置冷卻，濾過后，續(xù)取濾液25 ml，加水20 ml，蒸干甲醇至約20 ml，用三氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并上述三氯甲烷液，揮干溶液，殘?jiān)偌舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，加適量甲醇至刻度，搖勻后，即為供試品的溶液。另外，取齊墩果酸對照品，加入甲醇制備成每毫升中含0.5 mg的溶液，作為對照品備用。參照《中華人民共和國藥典》2015年版通則0502項(xiàng)下薄層色譜法，精密吸取上述兩種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(8∶1∶5)為展開劑，經(jīng)展開后取出，晾干，再噴10%的硫酸乙醇溶液，薄層板在105 ℃溫度加熱至斑點(diǎn)清晰顯色。作為供試品的薄層色譜中，在相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果詳見圖1～圖3。

圖1 梔子根齊墩果酸薄層色譜鑒別圖

圖2 梔子莖齊墩果酸薄層色譜鑒別圖

圖3 梔子枝齊墩果酸薄層色譜鑒別圖

2.2 以齊墩果酸為參照指標(biāo)的高效液相色譜定量評價

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對照品適量置5 ml量瓶中，加甲醇定容配置成對照品儲備液，再精密移取一定量對照品儲備液于量瓶中，加甲醇定容制成含齊墩果酸1428.00 μg/ml對照品溶液。對照品溶液置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.2 供試品溶液的制備齊墩果酸供試品溶液的制備：取梔子根樣品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，放置帶塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入4%的鹽酸甲醇溶液50 ml，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，用4%的鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，續(xù)取濾液25 ml，加水20 ml，蒸干甲醇至約20 ml，用三氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷液，溶液揮干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得。

2.2.3 色譜條件色譜柱：Platisil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.4%乙酸(B)，比例為97%A-3%B；流速為1 ml/min，等度洗脫15 min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl；檢測波長210 nm。該色譜條件下，齊墩果酸與其他相鄰峰的分離度大于1.5，理論板數(shù)不低于4000，對照品及樣品的色譜圖見圖4。

注：1.齊墩果酸圖4 齊墩果酸對照品(a)與梔子根樣品(b)HPLC圖

2.2.4 指標(biāo)成分方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，用甲醇依次稀釋配制成11.16、22.31、44.63、89.25、178.50、357.00、714.00、1428.00 μg/ml的8個系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下相應(yīng)色譜條件進(jìn)樣測定。以對照品濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y=2110.6X-3358.7，r=0.9999。結(jié)果表明，在11.16～1428.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4.2 精密度試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取齊墩果酸對照品溶液，按上文“2.2.3”項(xiàng)下相應(yīng)的色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分峰面積的RSD值。結(jié)果齊墩果酸的RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取梔子根藥材粉末約1 g，按上文方法平行制備6份供試品溶液，并按上述色譜條件測定，測定各種成分含量，計(jì)算含量的RSD值。結(jié)果齊墩果酸的RSD為2.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，在0、2、4、8、16、24 h分別按上文中色譜條件進(jìn)樣，記錄各種成分的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果齊墩果酸的RSD為0.45%，表明供試品溶液中齊墩果酸成分在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的藥材粉末0.5 g，平行制備6份溶液，分別加入一定量的對照品溶液，按上文方法制備供試品溶液，按上文色譜條件測定，計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果見表2。

表2 梔子根中齊墩果酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 含量測定精密稱取梔子根樣品、梔子莖樣品、梔子枝樣品粉末(樣品采自漳州龍海港尾)約1 g，按上文方法制備供試品溶液，按上文色譜條件進(jìn)行測定，每個樣品平行3份，計(jì)算樣品中齊墩果酸的含量。結(jié)果見表3。

表3 梔子不同部位的含量測定結(jié)果

3 討論

梔子根在急性及傳染性肝炎的治療方面療效顯著，其作為福建地方常用傳統(tǒng)中藥，我院肝病中心于上世紀(jì)五六十年代即開始廣泛應(yīng)用梔子根，歷史悠久。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2007—2014年我院門診藥房調(diào)劑使用梔子根每年800～1500 kg(不包含醫(yī)院制劑、中藥免煎顆粒)。肝病中心特色醫(yī)院制劑茵梔顆粒、復(fù)方梔子根顆粒、康氏抗纖方、康氏系列方等在廣大患者中享有較高的信譽(yù)，其處方均以梔子根為君藥配伍應(yīng)用[3]。臨床用于治療慢性丙型肝炎的中成藥制劑松梔丸，其組方以梔子根為君藥配伍組成。梔子根用藥部位為梔子植株根部，不利于生態(tài)環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展，且對藥材來源范圍局限性顯著；目前藥材市場上供應(yīng)的梔子根常混有莖、枝等部位，時而出現(xiàn)混有較高比例莖枝的藥材。本實(shí)驗(yàn)對梔子根、莖、枝等部位進(jìn)行較為系統(tǒng)、全面的研究，以期為臨床提供品質(zhì)良好、質(zhì)量穩(wěn)定的梔子根藥材提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

《福建省中藥飲片炮制規(guī)范》(2012年版)[4]梔子根鑒別項(xiàng)下，其薄層色譜鑒別法采用的對照品為梔子根對照藥材，在本實(shí)驗(yàn)研究過程中無法采購到其對照藥材，故本實(shí)驗(yàn)研究未選用梔子根對照藥材作為對照品。目前，《浙江省中藥炮制規(guī)范 》(2015年版)[5]、《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范 》(2010年版)[6]等多省份《炮制規(guī)范》和藥材標(biāo)準(zhǔn)、或飲片標(biāo)準(zhǔn)中采用了齊墩果酸作為梔子根薄層色譜鑒別的參照指標(biāo)，故本實(shí)驗(yàn)研究采用齊墩果酸作為薄層色譜鑒別的參照指標(biāo)。目前各省標(biāo)準(zhǔn)以齊墩果酸作為薄層色譜鑒別指標(biāo)的方法步驟中，梔子根樣品需水解回流提取，操作復(fù)雜耗時長，且萃取過程中需要用到大量三氯甲烷，毒性較大，該方法尚需進(jìn)一步優(yōu)化。本研究顯示在以齊墩果酸為參照指標(biāo)的薄層色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，梔子根、莖、枝均顯示相同顏色的斑點(diǎn)，表明梔子根、莖、枝均含有齊墩果酸成分。

HPLC法測定梔子根中齊墩果酸含量，樣品處理方法簡單、易于操作，重現(xiàn)性及穩(wěn)定性良好，故可將齊墩果酸作為梔子根質(zhì)量評價的依據(jù)。梔子根的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究目前還處于起步階段，目前研究文獻(xiàn)多以齊墩果酸醋酸酯對其質(zhì)量進(jìn)行控制，且由于齊墩果酸醋酸酯對照品的局限性，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)以及實(shí)驗(yàn)研究中多通過將其水解為齊墩果酸，以齊墩果酸總含量對山里黃根質(zhì)量進(jìn)行評價?！逗鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn) 2009年版》[7]中以齊墩果酸為指標(biāo)，通過薄層色譜法對山里黃根進(jìn)行鑒別，并增加HPLC高效液相色譜法對其質(zhì)量進(jìn)行評價；伍城穎等[8]在《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》HPLC法基礎(chǔ)上，對齊墩果酸醋酸酯提取水解方法進(jìn)行改進(jìn)，建立了更為簡單、易于操作的提取方法。本實(shí)驗(yàn)方法中，選用齊墩果酸含量作為對梔子根質(zhì)量評價依據(jù)，齊墩果酸對照品在210 nm 處有強(qiáng)吸收峰。色譜條件經(jīng)遴選設(shè)定流動相為甲醇(A)-0.4%乙酸(B)，比例為97%A-3%B，等度洗脫15 min。流速為1 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl；檢測波長210 nm。該色譜條件下，齊墩果酸與其他相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于4000。課題組選擇齊墩果酸用于梔子根的質(zhì)量評價的主要指標(biāo)成分。

本研究在進(jìn)行梔子根、莖、枝等不同部位中藥指紋圖譜質(zhì)量控制模式實(shí)驗(yàn)中，選用的對照品為齊墩果酸、山梔苷、去乙酰車葉草酸甲酯、雞矢藤次苷甲酯、綠原酸、隱綠原酸、羥異梔子苷，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，梔子的莖、枝與根樣品相似度在0.9以上，葉、果實(shí)、花與根的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量及含量相差較大，相似度均低于0.9，與梔子味苦，性寒，功效瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒；梔子根味甘、苦，性寒，功效清熱利濕、涼血止血，兩者主要功效有較明顯的差別相一致。肖日傳等[9]基于多波長HPLC-DAD比較梔子不同部位化學(xué)成分差異，結(jié)果也表明，梔子不同部位各成分含量差異較大，梔子根、莖與果實(shí)、葉差異明顯。

本實(shí)驗(yàn)研究中齊墩果酸作為評價梔子根質(zhì)量的指標(biāo)性成分，為梔子不同部位的質(zhì)量評價控制和梔子藥材資源的綜合開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)研究表明，梔子根、莖、枝3個部位中齊墩果酸均具有顯著差異，齊墩果酸含量順序?yàn)楦?莖>枝，梔子根齊墩果酸含量較梔子莖相對接近。肖日傳等[9]研究提示，竹節(jié)參皂苷Ⅳa為梔子根中的主要化學(xué)成分之一，表現(xiàn)有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用，同時可抗心律失常，對Ⅱ型糖尿病合并腦缺血/再灌注有保護(hù)作用等。在對梔子根指標(biāo)成分齊墩果酸研究的基礎(chǔ)上，下一步須對梔子根的其他指標(biāo)組分竹節(jié)參皂苷Ⅳa等進(jìn)行研究，同時對梔子根、莖、枝不同部位進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用情況的調(diào)研及臨床使用病例的收集、整理、分析。中藥多為多組分協(xié)同作用發(fā)揮功效，梔子莖能否作為梔子根的來源，能否替代梔子根，擴(kuò)大梔子根用藥部位，保護(hù)生態(tài)環(huán)境和資源可持續(xù)發(fā)展，尚有待下一步藥效學(xué)等多方面的探索和研究。