武文博 朱美意 歐陽(yáng)軍 (石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科，新疆 石河子 832000)

肝臟是體內(nèi)以代謝功能和再生能力為主的最大內(nèi)臟器官，然而在生理狀態(tài)下，絕大部分肝細(xì)胞正處于穩(wěn)態(tài)，在受到外傷、感染、中毒、部分肝切除等損害因素造成肝臟受損后，存留的肝細(xì)胞會(huì)快速增生修繕受損部位，進(jìn)而程序性表達(dá)極強(qiáng)的再生能力〔1～4〕。同時(shí)，肝臟的增殖重建涵蓋復(fù)雜的病理生理全過程，牽涉到很多種細(xì)胞內(nèi)外影響增殖及凋亡蛋白的調(diào)節(jié)。但是，肝損害后增殖修復(fù)的明確分子機(jī)制仍未全然認(rèn)清。

1993年美國(guó)麻省理工學(xué)院的以色列籍科學(xué)家Nedivi及其同事發(fā)現(xiàn)Neuritin〔5〕是一種活性誘導(dǎo)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，曾經(jīng)普遍視為其高度自限在神經(jīng)細(xì)胞。2005年日本學(xué)者Nobuhiko研究發(fā)現(xiàn)Neuritin蛋白的表達(dá)水平隨著肝臟的發(fā)育成熟而逐漸增高，成年小鼠的Neuritin蛋白表達(dá)量最多。同時(shí)，將成年小鼠的肝臟部分切除后Neuritin蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)一過性降低，術(shù)后24 h伴隨肝臟再生的開始，Neuritin蛋白的表達(dá)量隨之升高，其升高水平與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1(cyclinD1是肝臟成熟和再生的指標(biāo))一致〔6〕。據(jù)此可知Neuritin蛋白具備促使肝臟再生修復(fù)的功能。

課題組通過酵母雙雜交技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 Neuritin 與多條細(xì)胞增殖的基因有相互作用，熱休克蛋白(HSP)60包含其中。HSP60是HSP家族的核心成員，最核心的功能是分子伴侶〔7〕，參與細(xì)胞周期與凋亡的調(diào)控〔6，8，9〕。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3是Caspase家族中最重要的成員，現(xiàn)在被認(rèn)為是細(xì)胞調(diào)亡過程中最重要的終末剪切酶，細(xì)胞凋亡絕大部分都要依賴Caspase-3誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通道進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡〔10〕。但是Neuritin和HSP60在肝細(xì)胞內(nèi)對(duì)Caspase-3的調(diào)控通路仍未確切。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討Neuritin與HSP60在肝細(xì)胞中的表達(dá)水平及對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 BRL大鼠肝細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；Neuritin抗體、HSP60抗體、Caspase-3抗體(Abcom 公司)；Neuritin蛋白(Sino Biological公司)；HSP60蛋白(Abcom 公司)；Marker(Thermo Scientific公司)，β-actin抗體(中杉金橋公司)；NC膜(Whatman公司)；DMEM液體培養(yǎng)基(Heclone 公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金橋公司)；與一抗對(duì)應(yīng)的免疫熒光二抗(Bioss公司)；Western印跡、免疫熒光所需各種儀器設(shè)備。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) (1)將BRL大鼠肝細(xì)胞放于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基貼壁繁殖；待細(xì)胞貼壁率達(dá)95%～100%，吸出舊培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化傳代，再次加入1 ml DMEM培養(yǎng)基中止消化，800 r/min離心5 min，吸走上清液。(2)將含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸后緩緩吹打肝細(xì)胞，待其分散成單個(gè)肝細(xì)胞，將細(xì)胞懸液按照1∶3的比例接種至新的培養(yǎng)皿中，飽和濕度、37℃、5%CO2、95%空氣恒溫培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)，間隔8 h進(jìn)行換液。

1.2.2干預(yù) (1)待培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好，長(zhǎng)至60%，準(zhǔn)備好干預(yù)。(2)將上述培養(yǎng)皿，隨機(jī)分為4大組，分別為Neuritin低表達(dá)組、Neuritin高表達(dá)組、HSP60低表達(dá)組、HSP60高表達(dá)組。每個(gè)大組分為5個(gè)小組，對(duì)照組(n=4)和實(shí)驗(yàn)組(n=16)，對(duì)照組不做任何處理，Neuritin低表達(dá)組實(shí)驗(yàn)組分別給予0.1 、0.3、0.5、0.7 μg/ml的Neuritin抗體；Neuritin高表達(dá)組實(shí)驗(yàn)組分別給予0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的Neuritin蛋白；HSP60低表達(dá)組實(shí)驗(yàn)組分別給予0.6、0.8、1.0、1.2 μg/ml的HSP60抗體；HSP60高表達(dá)組實(shí)驗(yàn)組分別給予10、50、100、200 ng/ml的HSP60蛋白，BRL肝細(xì)胞培養(yǎng)48 h后使用Western印跡檢驗(yàn)Neuritin、HSP60及Caspase-3在肝細(xì)胞中的表達(dá)量。

1.2.3Western印跡法 BRL肝細(xì)胞培養(yǎng)48 h后分別提取上述各組細(xì)胞蛋白，5×十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解緩沖液裂解細(xì)胞，測(cè)各組蛋白濃度，調(diào)平每組蛋白提取液濃度時(shí)采用細(xì)胞降解液，獲取肝細(xì)胞總蛋白，100℃煮沸8 min，12 000 r/min離心5 min，獲取上清液。15 μl目的蛋白經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出來(lái)后采用電轉(zhuǎn)移至NC膜上，使用5%脫脂奶粉TBST封閉2 h，分別加一抗(Neuritin抗體1∶500、HSP60抗體1∶20 000、Caspase-3抗體1∶300、β-actin 抗體 1∶1 000)，4℃ 過夜。TBST溶液洗膜4次(1次5 min、3次15 min)，對(duì)應(yīng)的二抗〔辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)1∶2 500，辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)1∶2 500〕。用ECL發(fā)光試劑盒顯影檢測(cè)蛋白印跡條帶，Quantity one 分析蛋白條帶灰度值。運(yùn)用目地蛋白條帶灰度值和相應(yīng)的β-actin灰度值之比視為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光 將六孔板中生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的肝細(xì)胞使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次2～3 min，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，每次2 min，0.2%TritonX-100透化3 min，PBS清洗，5%牛血清白蛋白(BSA)37℃封閉30 min，倒去封閉液，同時(shí)加一抗(Neuritin抗體1∶100、HSP60抗體1∶100)置于濕盒4℃過夜，第二天復(fù)溫后PBS清洗，在暗室加PBS稀釋后的熒光二抗(1∶50)37℃、2 h，PBS沖洗3次，滴加抗熒光淬滅劑封片，最后使用共聚焦顯微鏡觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad8.0軟件進(jìn)行方差分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1Neuritin低表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì)HSP60及Caspase-3變化的影響 與對(duì)照組相比，0.1、0.3、0.5、0.7 μg/ml的Neuritin抗體組Neuritin相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低，Caspase-3相對(duì)表達(dá)量逐漸增高(均P<0.05)；各組HSP60相對(duì)表達(dá)水平基本一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1，圖1。

表1 Neuritin低表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì)HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對(duì)照組、0.1、0.3、0.5、0.7 μg/ml的Neuritin抗體組

2.2Neuritin高表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì)HSP60及Caspase-3變化的影響 與對(duì)照組相比，0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的Neuritin蛋白組Neuritin相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高，Caspase-3相對(duì)表達(dá)程度逐漸減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；HSP60相對(duì)表達(dá)水平基本一致，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見表2，圖2。

表2 Neuritin高表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì)HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對(duì)照組、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的Neuritin蛋白組

2.3HSP60低表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì) Neuritin及Caspase-3變化的影響 與對(duì)照組相比，0.6、0.8、1.0、1.2 μg/ml的的HSP60抗體組HSP60相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低，Caspase-3相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；各組Neuritin相對(duì)表達(dá)程度基本相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3，圖3。

表3 HSP60低表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì)HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對(duì)照組、0.6、0.8、1.0、1.2 μg/ml的HSP60抗體組

2.4HSP60高表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì)Neuritin及Caspase-3變化的影響 與對(duì)照組相比，10×10-3、50×10-3、100×10-3、200×10-3μg/ml的Hsp60蛋白組HSP60相對(duì)表達(dá)水平逐漸增高，Caspase-3相對(duì)表達(dá)水平漸漸減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；各組Neuritin相對(duì)表達(dá)程度基本相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4，圖4。

表4 HSP60高表達(dá)在肝細(xì)胞中對(duì)HSP60及Caspase-3變化的影響

1～5：對(duì)照組、10×10-3、50×10-3、100×10-3、200×10-3 μg/ml的HSP60蛋白組

2.5Neuritin、HSP60在肝細(xì)胞內(nèi)和Caspase-3的相關(guān)性分析 Neuritin低表達(dá)組和Neuritin過表達(dá)組中，Neuritin表達(dá)與Caspase-3表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.993，P<0.05)(圖5)；HSP60低表達(dá)組和HSP60高表達(dá)組中，HSP60表達(dá)與Caspase-3表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.996，P<0.05)(圖6)。

圖5 Neuritin和Caspase-3的相關(guān)分析

圖6 HSP60和Caspase-3的相關(guān)性

3 討 論

引發(fā)細(xì)胞凋亡程序的因素主要是通過Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞增殖和凋亡程序中起著關(guān)鍵作用是線粒體通道，然而在凋亡調(diào)控基因中，最受矚目的是Bcl-2 家族、Caspase家族，其中抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和促凋亡蛋白Bax蛋白是目前為止在凋亡調(diào)節(jié)進(jìn)程中基本功能彼此對(duì)立的一對(duì)不可或缺的調(diào)節(jié)蛋白〔11〕。Caspase-3的活性和細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)，主要通過細(xì)胞色素(Cyt)C的釋放進(jìn)而影響線粒體通道誘導(dǎo)的Caspase凋亡。當(dāng)細(xì)胞接收到來(lái)自凋亡的信號(hào)，如外源性信號(hào)(大部分肝切除、電離輻射、化療藥物等)，或內(nèi)源性因素〔Neuritin、HSP60、活性氧(ROS)生成等〕，引發(fā)Bax和Bcl-2激活，導(dǎo)致線粒體膜兩側(cè)化學(xué)濃度差消失，跨線粒體膜兩側(cè)電位梯度消失，線粒體基質(zhì)中儲(chǔ)存的Ca2+釋放導(dǎo)致線粒體膜通透性增高并大量釋放CytC〔12～15〕。CytC釋放入細(xì)胞質(zhì)后與Caspase結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而使信號(hào)傳遞至下游Caspase-3，最后使細(xì)胞凋亡信號(hào)持續(xù)傳送下去〔16,17〕。

研究表明Neuritin、HSP60參與細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控〔18〕。人類Neuritin基因〔候選可塑性基因(CPG)15〕位于6號(hào)染色體上(6p25.1)；長(zhǎng)2 072 bp；并且在物種間高度保守，人與鼠之間的同源性高達(dá)97%(cpg15)。其在神經(jīng)元可塑性和再生中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還涉及抗細(xì)胞凋亡、血管生成、腫瘤發(fā)生等生物過程。研究發(fā)現(xiàn)胚胎腦中表達(dá)的可溶性Neuritin可以通過阻止Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，來(lái)抑制皮質(zhì)祖細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而調(diào)節(jié)其存活〔19〕。有文獻(xiàn)報(bào)道Neuritin在施萬(wàn)細(xì)胞中同樣也有表達(dá)〔20〕。在過量表達(dá)Neuritin的施萬(wàn)細(xì)胞中克隆Bcl-2的功能，導(dǎo)致Caspase-3活性增加，從而增加細(xì)胞凋亡。這顯示了該途徑中Neuritin與Bcl-2的關(guān)系。隨著細(xì)胞凋亡的變化，Caspase-3和Caspase-9的活性發(fā)生了相應(yīng)的變化。同樣的，研究發(fā)現(xiàn)〔21〕通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)上調(diào)Neuritin表達(dá)，類胰島素1號(hào)增長(zhǎng)因子(IGF1)可以施萬(wàn)施萬(wàn)細(xì)胞的凋亡，Neuritin是該途徑的下游元素，研究表明，在體外高血糖癥狀下，Neuritin是IGF1對(duì)施萬(wàn)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑或介質(zhì)，至少通過抗凋亡元件Bcl-2。研究發(fā)現(xiàn)外源性IGF1在一定程度上阻止了施萬(wàn)細(xì)胞暴露于高血糖的細(xì)胞凋亡。在給定的高血糖水平下，Neuritin介導(dǎo)IGF1的作用，IGF1的作用隨劑量而變化。研究表明IGF1可能是抗細(xì)胞凋亡途徑的上游調(diào)節(jié)因子：PI3K-Neuritin-Bcl-2-Caspase-3〔21〕。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)通過使Neuritin低表達(dá)及高表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，Neuritin和Caspase-3呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，并且影響Neuritin的表達(dá)水平，并不能影響HSP60的表達(dá)。結(jié)合上述研究筆者歸納其機(jī)制可能為Neuritin激活Bcl-2抗細(xì)胞凋亡作用，從而影響Caspase-3的表達(dá)，最后起到抗細(xì)胞凋亡的作用。

以往研究證實(shí)HSP60是重要的線粒體分子伴侶，然而如今研究發(fā)現(xiàn)HSP60同時(shí)存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)〔10〕。目前研究表明 HSP60 的主要功能如下：①參與新生蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝及變性蛋白質(zhì)的恢復(fù)過程；②在細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡中起到調(diào)控作用；③參與蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移；④具有抗氧化功能；⑤在免疫中起作用〔6,9,10〕。HSP60作為分子伴侶的確切作用機(jī)制尚不明確，因?yàn)閾?jù)報(bào)道它可以促凋亡或抗細(xì)胞凋亡〔22〕。Gupta等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)在心臟細(xì)胞質(zhì)中HSP60與Bax，Bak和Bcl-XL復(fù)合，但不與Bcl-2復(fù)合。HSP60表達(dá)的減少促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但不改變線粒體功能。在缺氧期間HSP60在細(xì)胞分布位置發(fā)生變化，HSP60離開細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜。總細(xì)胞HSP60直到復(fù)氧(10 h才改變；然而，CytC從線粒體釋放發(fā)生在再氧合之前，與HSP60的重新分布一致。在缺氧期間HSP60、Bax和HSP的變化，CytC可以通過三磷酸腺苷(ATP)消耗來(lái)復(fù)制。HSP60也被證明可以加速pro-Caspase-3的裂解。因此，HSP60在細(xì)胞凋亡程序中起關(guān)鍵作用。HSP60在正常條件下與Bax的結(jié)合表明其在細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。同樣的Caruso Bavisotto等〔22〕研究報(bào)道雙(吡啶基)惡二唑酮絡(luò)合物(CubipyOXA)的促細(xì)胞凋亡作用可能是使HSP60水平的降低和其阻斷HSP60/pro-Caspase-3復(fù)合物的形成，因此阻礙了HSP60的抗細(xì)胞凋亡作用。腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)中HSP60激活ERK和Akt，減少Bax和CytC釋放及Caspase-3級(jí)聯(lián)的凋亡信號(hào)傳遞〔24〕。HSP60信號(hào)傳導(dǎo)的喪失有助于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的促凋亡反應(yīng)的增強(qiáng)，從而加速成骨細(xì)胞凋亡和骨質(zhì)量損失〔25〕。本實(shí)驗(yàn)通過在肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)使HSP60低表達(dá)及高表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，HSP60和Caspase-3表達(dá)水平顯現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，并且影響HSP60的表達(dá)水平，并不能影響Neuritin的表達(dá)。進(jìn)而推斷HSP60可能通過抑制Bax的促細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而影響Caspase-3的表達(dá)，最后呈現(xiàn)出抗細(xì)胞凋亡的作用。

由本研究結(jié)果可知，HSP60與Neuritin低表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而HSP60與Neuritin過表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。筆者推測(cè)HSP60和Neuritin可能通過某種協(xié)同作用共同參與肝細(xì)胞的抗凋亡調(diào)控機(jī)制。