張維文 張方圓 方 玲 王曉莉 魏 琰

（衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，衡水 053000）

缺血性中風急性期會造成軸突迅速而大量的損失，據(jù)報道其治療每延遲1 min，就會導致7 英里的軸突丟失[1]。早期軸突丟失是由于原發(fā)缺血性損傷引起的鈣信號激活蛋白水解酶和下游信號級聯(lián)反應；第2 階段軸突進行性損傷發(fā)生在中風亞急性期，急性期幸存軸突由于軸突-膠質(zhì)接觸和軸突能量代謝紊亂將發(fā)生軸突變性[2]。軸突再生、神經(jīng)重塑及神經(jīng)環(huán)路重建對腦梗死遺留神經(jīng)功能障礙的恢復起著至關重要的作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中損傷軸突的再生需具備2 個因素：激活神經(jīng)元中軸突生長基因表達和信號通路等內(nèi)在因素，抑制影響軸突再生的負性外源因素，如膠質(zhì)瘢痕、軸突再生抑制分子及信號通路等[3]。研究已表明外源性拮抗神經(jīng)突起生長抑制因子A（neurite outgrowth inhibitor-A，Nogo-A）表達能夠增強軸突再生和神經(jīng)元可塑性，改善腦梗死后神經(jīng)功能障礙[4]。最新研究表明大鼠腦梗死后，電刺激小腦頂核區(qū)域可上調(diào)軸突生長相關蛋白（growth associated protein-43，GAP-43）的表達，進而促進大鼠運動功能的恢復[5]。本研究應用線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，探討跑臺運動訓練是否可調(diào)控缺血半暗帶區(qū)GAP-43 與Nogo-A、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表達，促進軸突再生和神經(jīng)功能恢復。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性成年Wistar 大鼠90 只，8 周齡，體質(zhì)量（250～280）g，由北京維通利華生物技術有限公司提供。按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、訓練組，每組30 只。每組依據(jù)2 個時間點（14 d，28 d）將動物分為 2 個亞組，每個亞組15 只動物。

1.2 藥品和儀器

兔抗大鼠GAP-43、Nogo-A和GFAP多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體購自北京博奧森生物有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；SABC免疫組織化學檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA試劑盒與DAB顯色試劑盒購福州邁新生物有限公司；2，3，5一氯化三苯基四氮唑購自美國Sigma公司；Solarbio蘇木精-伊紅染色試劑盒 購自北京索萊寶公司。電動跑臺儀（Exer3/6R型，美國哥倫布儀器有限公司）；大鼠腦立體定向儀（上海江灣醫(yī)療器械廠）；微量注射器（杭州科曉化工儀器設備有限公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 腦梗死模型制備

參照文獻[6]采用線栓法制備左側大腦中動脈閉塞模型。采用 0.8%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后將大鼠仰臥固定于臺上，分離左側頸總動脈，穿線備用；依次分離左側頸外動脈、頸內(nèi)動脈并依次結扎；動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠心端；在頸內(nèi)動脈與頸外分叉的近心端剪T 型切口，將線栓輕插入頸內(nèi)動脈，當感到有阻力時，停止插線，距頸內(nèi)動脈與頸外動脈分叉處約（18.5±1.5）mm，證明線栓頭端已經(jīng)進入大腦中動脈處，扎緊備線，消毒、縫合皮膚。

1.4 跑臺運動訓練

手術前各組研究大鼠均在電動跑臺儀上進行適應性跑步訓練3 d。運動訓練組大鼠于腦梗死模型制備成功后24 h 給予跑臺訓練，每天訓練30 min。電動平板斜度為0，第1 天運動速度為4 m/min，第2 天增加至 8 m/min，第3 天增加至12 m/min，然后保持該速度分別訓練至造模后14 d 及28 d。假手術組及模型組每日亦置于跑臺上30 min，但不進行跑步運動。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分

各組大鼠術后14 d、28 d，采用改良神經(jīng)功能缺損評分法（modified neurological severity score，mNSS） 評估大鼠神經(jīng)功能缺損程度，包括運動、感覺、平衡、反射等多個項目，總分為0～18 分，分數(shù)越高表明神經(jīng)功能缺陷更嚴重。

1.6 平衡木試驗

各組大鼠術后14 d，28 d，采用平衡木行走實驗來評估大鼠腦梗死后的肢體運動功能障礙。記錄大鼠走完平衡木所需要的腳步總數(shù)與錯誤腳步數(shù)，計算大鼠平衡木行走錯誤百分率=錯誤腳步數(shù)/腳步總數(shù)（正確腳步數(shù)與錯誤腳步數(shù)總和）。錯誤百分率越大說明大鼠運動功能缺損越嚴重。

1.7 腦梗死體積測定

用2，3，5-三苯基氯化四氮唑 （TTC） 染色法檢測大鼠腦梗死體積，大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，冠狀切片每組6 片（2 mm），TTC 染液中室溫染色30 min。使用Image J 分析軟件分析梗死體積百分比。依據(jù)公式：腦梗死百分比=腦梗死體積/ 腦片體積×100%。

1.8 H-E 染色

麻醉處死大鼠取組織，10% 甲醛溶液固定48～72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片（5 μm），石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染核10 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化1 min，水洗返藍2 h，伊紅染漿5 min，水洗脫水透明后中性樹膠封片。

1.9 免疫印跡檢測

稱取100 mg 血腫周圍組織，加入蛋白裂解液1 mL 和蛋白酶抑制劑中裂解，低溫組織勻漿后靜置30 min，低溫離心留取上清液。用BCA 試劑盒進行蛋白定量濃度測定，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，半干法電轉移至PVDF 膜上，PVDF 膜以5%BSA 封閉，分別滴加兔抗大鼠GAP-43、Nogo-A 和GFAP 多克隆抗體（均1∶500）、兔抗大鼠β-actin 單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。次日洗膜后滴加lgG-HRP 抗體（1∶5 000），室溫孵育2 h。ECL 化學發(fā)光液曝光，掃描并測定目標蛋白吸光度值，與內(nèi)參β-actin 比值后，計算目標蛋白的相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 跑臺訓練對大鼠神經(jīng)功能缺損影響

mNSS 結果顯示，假手術組大鼠mNSS 評分為0 分，提示神經(jīng)功能無缺損。14 d 與28 d 模型組大鼠mNSS 評分顯著高于相應時間點的假手術組（P＜0.05），評分在7～12 分之間，屬于中度神經(jīng)功能缺損。與模型組相比，跑臺訓練組大鼠的mNSS 評分明顯降低（P＜0.05），但仍高于假手術組（圖1）。

圖 1 各組大鼠神經(jīng)功能評分的比較Fig 1 Comparison of neurological dysfunction of rats in each group

2.2 跑臺訓練對大鼠行為學障礙的影響

在腦梗死后14、28 d，應用大鼠平衡木行走試驗檢測大鼠行為學改變。腦梗死大鼠患側前肢和后肢平衡木的錯誤百分率明顯高于假手術組（P＜0.05），提示嚴重的運動功能障礙。與模型組相比，跑臺訓練組大鼠的前肢和后肢行走錯誤率明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

圖 2 各組大鼠患側前肢、后肢運動功能的比較Fig 2 Comparison of affected forelimb and hindlimb function of rats in each group

2.3 跑臺訓練對大鼠腦梗死體積的影響

假手術組大鼠腦組織中未見梗死灶。與假手術組相比，模型組大鼠14 d 及28 d 均有不同程度的梗死灶形成（P＜0.05）。與模型組相比，跑臺訓練后大鼠腦梗死體積百分比顯著降低（P＜0.05）。結果表明運動訓練可以縮小腦梗死體積，促進腦損傷恢復（圖3）。

圖 3 各組大鼠腦梗死體積的比較Fig 3 Comparison of cerebral infarct volume of rats in each group

2.4 跑臺訓練對缺血半暗帶神經(jīng)元形態(tài)的影響

假手術組皮層神經(jīng)元排列整齊有序，神經(jīng)細胞結構清晰，細胞核藍染，大而圓。模型組大鼠缺血半暗區(qū)，細胞層次排列紊亂，組織間質(zhì)水腫，大量細胞壞死，錐體細胞核固縮、深染甚至溶解。跑臺訓練組大鼠缺血半暗帶腦組織間質(zhì)水腫減輕，細胞數(shù)量增加且形狀較為完整（圖4）。

2.5 跑臺訓練對軸突生長促進因子與抑制因子的調(diào)控作用

假手術組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)低水平GAP-43的表達，且高水平的Nogo-A 表達，在正常成年大鼠腦組織中兩者的表達模式可抑制軸突生長，維持突觸穩(wěn)定性。與假手術組比較，模型組大鼠缺血半暗帶GAP-43 表達升高，Nogo-A 蛋白水平降低（P＜0.05），此變化可促進軸突出芽與延伸，啟動自我修復機制。與模型組相比，跑臺訓練組大鼠GAP-43 表達進一步上調(diào)，Nogo-A 蛋白水平進一步下調(diào)（P＜0.05），更大強度促進腦梗死后的軸突再生和神經(jīng)重構（圖5）。

2.6 跑臺訓練對星形膠質(zhì)細胞增生的調(diào)控作用

GFAP是星形膠質(zhì)細胞特異性標志蛋白，星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞，所以在假手術組大鼠有較高的基礎表達水平。模型組14、28 d大鼠缺血半暗帶GFAP表達較相應時間點假手術組顯著增多（P＜0.05）。與相應時間點模型組相比，跑臺訓練組大鼠GFAP表達明顯降低（P＜0.05），抑制星形膠質(zhì)細胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成，易于軸突再生（圖6）。

圖 4 各組大鼠14 d（A1～C1）、28 d（A2～C2）大腦皮質(zhì)組織形態(tài)學比較，×400Fig 4 Comparison of cerebral cortex morphology of rats in each group at 14 d（A1-C1） and 28 d（A2-C2），×400

圖 5 大鼠大腦皮質(zhì)GAP-43 與Nogo-A 的蛋白表達Fig 5 Expression of GAP-43 and Nogo-A protein in the cortex of rats

圖 6 大鼠大腦皮質(zhì)GFAP 的蛋白表達Fig 6 Expression of GFAP protein in the cortex of rats

3 討論

腦梗死后期遺留持久嚴重的認知和神經(jīng)功能障礙尚無特效治療方案。有研究表明軸突再生是大腦損傷修復的一個重要方面，有助于自發(fā)性腦缺血后神經(jīng)功能障礙的改善[7]。因此尋找促進腦梗死缺血半暗帶區(qū)軸突再生和突觸形成，恢復神經(jīng)功能的治療方法至關重要。本研究采用線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，探討跑臺運動訓練對腦梗死缺血半暗帶軸突再生及大鼠神經(jīng)功能的影響。實驗數(shù)據(jù)顯示：跑臺訓練后腦梗死大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯降低，神經(jīng)元損傷程度降低，運動功能障礙恢復。同樣有文獻表明運動訓練可以顯著改善缺血性腦損傷誘導的運動、感覺及認知功能障礙，其機制與調(diào)控mRNA 翻譯、細胞骨架重構及突觸可塑性相關[8]。另外早期運動訓練可以調(diào)節(jié)腦水腫、細胞凋亡、氧化損傷及干細胞等，從而對大腦發(fā)揮神經(jīng)保護作用[9]。本研究結果及如上文獻證實了腦梗死后早期運動訓練的積極治療效果。但是也有證據(jù)表明腦缺血損傷后早期給予運動訓練可以增加細胞應激反應及大量炎癥因子的釋放，擴大腦損傷[10]。針對腦缺血后的早期炎癥反應，和造模所帶給動物的急性應激狀態(tài)，早期運動干預有可能會加重早期神經(jīng)炎性損傷。但是就與軸突再生、突觸形成、神經(jīng)環(huán)路重建等相關的神經(jīng)功能恢復的遠期效應考慮，早期給予運動訓練可能發(fā)揮積極的神經(jīng)保護作用。本研究主要探討了早期跑臺訓練對腦梗死大鼠缺血半暗帶區(qū)軸突再生的調(diào)控作用。

在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元內(nèi)在生長能力被抑制以穩(wěn)定突觸環(huán)路。在軸索損傷后，啟動內(nèi)在分子生長程序，壓制生長抑制環(huán)境，可喚起軸突再生能力。GAP-43 在神經(jīng)元發(fā)育和突觸形成過程中呈高表達，參與軸突再生，突觸可塑性及學習記憶功能的調(diào)控[11]。GAP-43 被認為是缺血后神經(jīng)元損傷的早期敏感標志物，在嚙齒類模型中已經(jīng)證實梗死周圍區(qū)域的GAP-43 水平明顯升高[12]。與本實驗研究結果一致，免疫印跡結果顯示：在腦梗死后14 d 與28 d 缺血半暗帶腦組織GAP-43 表達量明顯高于假手術組。1 項重要臨床研究顯示在28 名缺血性中風患者的腦脊液中GAP-43 濃度也顯著升高，并與中風的嚴重程度和白質(zhì)缺損萎縮體積呈正相關[13]。本研究結果顯示大鼠腦梗死早期給予跑臺訓練干預持續(xù)至14 d 或28 d 均可顯著上調(diào)缺血半暗帶GAP-43 的水平。

Nogo是抑制神經(jīng)再生的基因，可翻譯3種主要蛋白質(zhì)Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，但只有Nogo-A具有強大的軸突生長抑制活性，且特異性分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)[14]。在缺血性中風小鼠模型中，應用中性抗體抑制Nogo-A和Nogo-A敲除小鼠可增強軸突的再生及延伸，修復損傷神經(jīng)元，改善神經(jīng)功能障礙[15-16]。本研究結果表明，腦梗死可誘導Nogo-A蛋白在缺血半暗帶區(qū)呈現(xiàn)高表達，Cheatwood 等[17]報道在28 d MCAO大鼠模型中，高表達的Nogo-A主要定位在缺血皮質(zhì)的錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元。同時早期跑臺訓練可以顯著降低缺血誘導的Nogo-A蛋白高表達。這樣可以抑制不利于軸突再生的外在環(huán)境干擾，通過GAP-43啟動內(nèi)在再生途徑。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細胞類型，在缺血性腦損傷病理進程中扮演多重角色：首先通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗興奮毒性效應限制腦梗死面積的擴大；其次產(chǎn)生大量的神經(jīng)炎性因子加速缺血誘導的腦損傷，再者膠質(zhì)細胞增生形成的瘢痕阻隔軸突再生，不利于神經(jīng)功能的修復[18]。GFAP屬于細胞骨架中的中間絲成分，是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物。據(jù)報道缺血性腦損傷后星形膠質(zhì)細胞反應性膠質(zhì)化，GFAP及軸突生長抑制分子的表達增加[19]。在GFAP 和波形蛋白雙敲除小鼠中，可以抑制缺血損傷后的反應性膠質(zhì)化和膠質(zhì)瘢痕形成，進而促進軸突再生和小鼠運動功能恢復[20]。本實驗表明，早期運動訓練可以顯著抑制缺血半暗帶皮質(zhì)中GFAP的表達量，抑制星形膠質(zhì)細胞的增生及膠質(zhì)瘢痕形成，促進軸突再生和神經(jīng)重構。

綜上所述，本研究證實早期運動訓練可以縮小腦梗死面積，減弱神經(jīng)元損傷程度，并促進腦梗死大鼠神經(jīng)功能的恢復。其機制可能通過上調(diào)缺血半暗帶區(qū)軸突生長正性調(diào)控因子GAP-43 表達，下調(diào)軸突生長負性調(diào)控因子Nogo-A 和GFAP，促進軸突再生和神經(jīng)可塑性，改善神經(jīng)功能。