楊日云 潘靜瑩 李 奕 吳 堅 王曉冬

（南通大學醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，南通 226001）

少突膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)有髓神經纖維髓鞘的形成細胞和腦白質的重要組成細胞，其損傷與多種疾病有關。少突膠質細胞和神經元一樣對缺氧極為敏感，缺氧誘導的少突膠質細胞損傷是導致新生兒腦白質損傷的最主要原因[1]。甲基萘醌-4（menaquinone-4，MK-4）是維生素K2（vitamin K2，VK2）的一種亞型，在除肝以外的器官中，VK2 可被轉換成MK-4[2-3]。同時，MK-4 是腦中維生素K 主要活性形式[4]。有研究表明，MK-4 可以促進胚胎后期大腦皮質、海馬和紋狀體的神經元存活[5]，抑制脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥反應[6]，降低發(fā)育中胚胎皮質神經元和少突膠質前體細胞因谷胱甘肽或花生四烯酸誘導的氧化應激損傷[7-8]。這些研究表明MK-4 在抗氧化應激和抗炎中起到一定作用。本研究通過低氧工作站體外模擬體內細胞真實的缺氧環(huán)境，探討MK-4 對缺氧少突膠質細胞的作用及其機制，為臨床上防治和治療缺氧導致的中樞神經系統(tǒng)疾病提供幫助。

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑

大鼠少突膠質細胞Oln-93細胞株購于北京中科質檢生物技術有限公司。MK-4 （河北科隆多生物科技有限公司） 溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） （Sigma），儲存 濃度為224.9 mmol/L，避光保存于-20℃。CCK-8試劑盒（日本同仁）；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCF-DA）、胰酶、多聚賴氨酸 （Sigma）；DMEM-F12培養(yǎng)基 （Thermo）；胎牛血清（Gibco）；青霉素-鏈霉素溶液（生工）；TRI Reagnet（Sigma）；逆轉錄試劑盒（Thermo）；SYBR Green PCR Kit （QIAGEN）。

1.2 細胞培養(yǎng)和缺氧模型的建立

Oln-93 細胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清的高糖DMEM-F12 培養(yǎng)基中，待細胞長滿進行傳代。將Oln-93 細胞接種于培養(yǎng)板，分為正常氧含量組和缺氧組。正常氧含量組用含10%FBS 的DMEM-F12 培養(yǎng)基，置于5% CO2/95% 空氣、37℃的培養(yǎng)箱中。缺氧組采用DWS H35 低氧工作站（5% CO2/95% N2，37℃）加無糖無血清的培養(yǎng)條件建立缺氧少突膠質細胞模型，分別缺氧4 、6 、12 h。

1.3 CCK-8 細胞活性檢測

Oln-93 細胞以每孔104細胞接種于96 孔板，每孔100 μL 細胞懸液，置于培養(yǎng)箱。次日，細胞分為正常氧含量組和缺氧組，并換成相應的培養(yǎng)基；在培養(yǎng)基中加入0.01% DMSO 或者1、2、4、8、15 μmol/L 的MK-4，預處理細胞20 min；接著將細胞置于正常氧含量培養(yǎng)箱或低氧工作站，分別培養(yǎng)4、6、12 h。終止孵育，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內孵育2 h。用Tecan M200 酶標儀測定在450 nm 處各孔的吸光度。每種濃度設置3 個復孔，實驗重復3 次。

1.4 二氫乙錠染色

Oln-93細胞接種于24孔板，用二氫乙錠染色檢測細胞內線粒體釋放活性氧 （radical oxygen species，ROS） 的量。用0.01% DMSO或者8 μmol/L MK-4預處理細胞，分別正常氧含量或缺氧孵育12 h。PBS 清洗細胞3 遍，每遍15 min。每孔加入50 μmol/L 二氫乙錠，避光37℃ 孵育30 min。采用激發(fā)光/激發(fā)光為485 nm/535 nm 共聚焦顯微鏡拍片。利用Image J 軟件計算單位面積平均熒光強度，統(tǒng)計比較正常氧含量組和缺氧組之間差異。實驗重復3 次，每組統(tǒng)計30 個細胞。

1.5 炎癥因子mRNA 的表達變化的檢測

0.01% DMSO或者8 μmol/L MK-4 預處理細胞20 min 后，分別正常氧或缺氧孵育12 h。用TRI Reagnet 提取各實驗組細胞的總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA。利用Primer 3 software version 1.0設計白介素-1 beta （interleukin-1 beta，IL-1β），白介素-6 （interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-alpha（tumor necrosis factor alpha，TNF-α），生長停滯特異性蛋白6 （growth arrest-specific 6，Gas6）基因和β-actin 的引物（表1）。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列Tab 1 Primer sequences in the real-time quantitative PCR

按照SYBR Green PCR Kit 說明書建立PCR 反應體系，實時熒光定量PCR 反應在Bio-rad CFX96 real time system 上進行。

1.6 統(tǒng)計學處理

利用Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數據以±s表示，采用實時熒光定量ANOVA 分析，每組實驗獨立重復3 次或以上。

2 結果

2.1 MK-4 對缺氧Oln-93 細胞活性的影響

為探究在缺氧環(huán)境下MK-4 對Oln-93 細胞活性的影響，采用不同MK-4 濃度和3 個缺氧時間點對Oln-93 細胞進行CCK-8 實驗。結果顯示：DMSO處理的Oln-93 細胞在分別缺氧4、6 h 和12 h 后，與DMSO 處理正常氧含量組相比細胞活性均顯著下降（圖1）。但當用2、4、8 μmol/L MK-4 處理后，缺氧4 h 的Oln-93 細胞活性相較于DMSO 處理缺氧組則顯著提高 （圖1A）。MK-4 濃度在2、4、8、15 μmol/L 時可顯著提高缺氧6 h 和12 h Oln-93 細胞的活性（圖 1B、C）。因此，2、4、8 μmol/L 濃度的MK-4 對缺氧Oln-93 細胞活性有顯著提高作用。綜合實驗結果，缺氧12 h 對Oln-93 細胞的損傷最大，且8 μmol/L MK-4 提高細胞的活性最顯著，因此選擇8 μmol/L MK-4 和缺氧12 h 進行后續(xù)研究。

2.2 MK-4 降低缺氧Oln-93 細胞內ROS 的產生

缺氧會影響線粒體功能[9]，為探究MK-4 對缺氧Oln-93 細胞線粒體功能的影響，采用二氫乙錠染色，檢測線粒體釋放ROS 的含量。細胞染色熒光強度與胞內ROS 含量呈正相關，熒光強度越高，則胞內ROS 含量越高。與DMSO 處理正常氧含量組相比，DMSO處理的大鼠Oln-93細胞在缺氧12 h后，胞內紅色熒光強度顯著增強；當8 μmol/L MK-4處理后，缺氧細胞內熒光強度對比加入DMSO 的缺氧組明顯減弱（圖2）。上述結果表明缺氧可以影響Oln-93 細胞線粒體功能，進而導致胞內ROS的大量釋放，但MK-4 可以明顯降低缺氧Oln-93細胞內ROS 的產生，進而達到保護細胞線粒體的作用。

圖1 MK-4 對缺氧Oln-93 細胞活力的影響Fig 1 Effects of MK-4 on the viability of hypoxic Oln-93 cells

圖2 MK-4 對缺氧Oln-93 細胞ROS 產生的影響，共聚焦顯微鏡，標尺=50 μmFig 2 Effects of MK-4 on ROS production of hypoxic Oln-93 cells，confocal microscope，bar=50 μm

2.3 MK-4 抑制缺氧Oln-93 細胞內促炎癥因子的表達

缺氧能夠誘導炎癥反應[10-11]；同時，線粒體在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，ROS 的大量產生可以導致炎癥[12]。既然MK-4 可以降低缺氧Oln-93 細胞線粒體ROS 的產生，那MK-4 是否參與缺氧Oln-93 細胞的炎癥反應。結果當DMSO 處理的Oln-93 細胞缺氧12 h 后，胞內促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平相較于DMSO處理正常氧含量組則明顯升高；但當用8 μmol/L MK-4 處理后，缺氧細胞內IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平相較于DMSO 處理缺氧組則明顯降低（圖3A～C）。以上結果表明，缺氧可以導致Oln-93 細胞內促炎因子的表達增加，引起細胞的炎癥，但MK-4 可以有效降低缺氧引起的Oln-93 細胞炎癥反應，進而達到保護細胞的作用。

2.4 MK-4 提高Oln-93 細胞內Gas6 基因的表達

Gas6 是維生素K 依賴蛋白，影響線粒體功能[13]，且可以抑制促炎細胞因子的表達[14]。既然MK-4 抑制缺氧Oln-93 細胞的ROS 產生和炎癥反應，那么Gas6 是否在其中充當重要角色。DMSO處理的Oln-93 細胞缺氧12 h 后，胞內Gas6 基因的mRNA 水平相較于DMSO 處理的正常氧含量組則明顯降低；但當8 μmol/L MK-4 處理后，缺氧細胞內Gas6 基因的mRNA 水平相較于DMSO 處理缺氧組則明顯升高（圖4）。以上結果表明，缺氧會降低Oln-93 細胞內Gas6 的含量，但MK-4 卻可以顯著提高缺氧Oln-93 細胞內Gas6 的表達。綜合之前的實驗結果，推測Gas6 可能參與了MK-4 對缺氧Oln-93 細胞的保護作用。

圖3 MK-4 對缺氧Oln-93 細胞促炎癥因子mRNA 表達的影響Fig 3 Effects of MK-4 on pro-inflammatory cytokine mRNA expression in Oln-93 cells

圖4 MK-4 對缺氧大鼠Oln-93 細胞Gas6 mRNA 表達的影響Fig 4 Effects of MK-4 on Gas6 mRNA expression in Oln-93 cells

3 討論

膠質細胞是神經系統(tǒng)中除神經元以外的另一大類細胞，其在神經系統(tǒng)中起重要作用。膠質細胞參與神經元的活動，對神經元具有支持、保護、營養(yǎng)、形成髓鞘和修復等多種功能，并且對多種中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生起重要作用[15]。中樞神經系統(tǒng)中的膠質細胞主要有星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞等，其中少突膠質細胞形成中樞神經系統(tǒng)髓鞘和組成腦白質。少突膠質細胞對缺氧高度敏感，新生的大鼠缺氧會造成白質少突膠質細胞衰竭和阻礙有髓神經纖維髓鞘的形成[16]。新生兒腦白質損傷與腦性癱瘓、智力低下等密切相關，其重要原因就是缺氧導致腦白質主要成分少突膠質細胞受損[17]。因此，研究少突膠質細胞的缺氧損傷機制和尋找缺氧少突膠質細胞的保護劑將會對腦白質損傷、脫髓鞘腦病等中樞神經系統(tǒng)缺氧性損傷具有重要意義。本研究區(qū)別以往常用的化學法缺氧模型，創(chuàng)新性地利用低氧工作站構建少突膠質細胞缺氧模型，更加真實模擬體內缺氧環(huán)境。

MK-4 又稱為VK2，臨床上MK-4 主要用于治療和預防血管鈣化、出血癥、骨質疏松癥、肝硬化發(fā)展成肝癌和帕金森病等[18-19]。MK-4 在鞘脂類的合成代謝中起重要作用，而鞘脂又與細胞增殖、分化和細胞間相互作用等多種細胞活動密切相關，進而影響神經系統(tǒng)的功能[20-21]。研究表明，MK-4 在大鼠腦中主要分布于有髓部分（腦橋、髓質、中腦）[22]。MK-4 可以作為線粒體電子載體保護受損線粒體的功能，維持正常ATP 產生[23]。MK-4 可以保護少突膠質前體細胞和未成熟神經元由于谷胱甘肽缺乏所引起的氧化應激損傷[7]。在由花生四烯酸誘導的少突膠質前體細胞的氧化應激損傷中，MK-4 可以有效抑制ROS 的積累，進而降低了細胞死亡率[8]。MK-4 可以通過抑制由脂多糖誘導的單核巨噬細胞NFκB 激活和IKKα/β 的磷酸化，進而抑制細胞內促炎因子IL-6 的表達[24]。綜上所述，MK-4 在中樞神經系統(tǒng)中主要分布于髓鞘，并且其在維持線粒體功能、抗氧化應激和抗炎癥中均表現出重要作用；因此需要更多研究MK-4 在與髓鞘形成相關細胞中所發(fā)揮的關鍵作用，為MK-4 在臨床上的進一步應用提供理論基礎。本研究主要探究了MK-4在缺氧少突膠質細胞中的作用，研究表明MK-4 可以有效抑制環(huán)境缺氧導致的少突膠質細胞線粒體ROS 的釋放，并且首次發(fā)現MK-4 可以通過抑制促炎細胞因子的表達來降低缺氧少突膠質細胞的炎癥反應，進而抑制了缺氧導致的少突膠質細胞死亡。那么MK-4 保護缺氧少突膠質細胞的作用是通過何種分子機制實現？

Gas6 是一種維生素K 依賴蛋白，其在大鼠的中樞神經系統(tǒng)中廣泛表達[25]。已有研究表明，Gas6 在神經元和膠質細胞中表現出促細胞存活、抗凋亡、促有絲分裂和促髓鞘形成的作用[4]。Gas6可以通過激活PI3K 信號通路來保護少突膠質細胞由TNF-α 誘導的細胞凋亡[26-27]。在多發(fā)性硬化癥模型中，Gas6 基因敲除的純合子小鼠相較于野生型小鼠存在更低的少突膠質細胞存活率，以及更多的細胞丟失和整體上髓鞘形成的減少[28]。減數分裂Ⅱ期卵母細胞的Gas6 基因敲除會導致其線粒體過度激活，引起ROS 的大量產生，進而損害卵母細胞細胞質的成熟[13]。研究表明，Gas6 可以抑制小鼠小膠質細胞因LPS 誘導的促炎因子IL-1β 的表達，進而降低細胞的炎癥反應[29]。本研究結果顯示缺氧可以導致少突膠質細胞內Gas6 的基因表達降低，但當用MK-4 預處理細胞后，缺氧少突膠質細胞內Gas6 的基因表達顯著升高。綜上所述，Gas6 具有促進細胞存活、調節(jié)線粒體ROS 的產生和調節(jié)中樞神經系統(tǒng)炎癥反應的作用，推測在本研究中MK-4 可能是通過調節(jié)缺氧少突膠質細胞內Gas6 的表達，進而保護細胞的線粒體功能，減少線粒體ROS 產生和降低細胞的炎癥反應，最終保護了缺氧少突膠質，提高其存活率。

本研究主要探討了MK-4 在缺氧少突膠質細胞中的作用。研究結果顯示缺氧可以導致少突膠質細胞大量死亡，且此作用可能是通過線粒體大量釋放ROS 和促炎細胞因子大量表達而引起的；但MK-4卻可以改善因缺氧導致的少突膠質細胞內ROS 釋放和促炎因子表達的紊亂，進而起到了保護細胞的作用。本研究提示Gas6 可能在MK-4 發(fā)揮作用的過程中扮演重要角色，為臨床上防治中樞神經系統(tǒng)缺氧性疾病和MK-4 更廣泛地應用提供理論支持。