侯東霞 侯麗青 烏云塔娜 周雪原 王曉華 冀小平

內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院（呼和浩特010060）

胚胎停育（embryo damage）是指在胎兒在母體子宮內(nèi)發(fā)育少于20 周即死亡的現(xiàn)象，是常見的惡性圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)疾病。胚胎停育有正常的早孕表現(xiàn)，可有或無先兆流產(chǎn)癥狀，可發(fā)展為自然流產(chǎn)、不全流產(chǎn)或稽留流產(chǎn)［1］。大約有15%～20%妊娠以早期自然流產(chǎn)而告終［2］，發(fā)病率高。造成胚胎停育的原因很多，包括胚胎染色體異常、母體內(nèi)分泌紊亂、母體免疫失調(diào)、精子DNA 完整性和環(huán)境因素等［3-4］。其中，染色體異常被認(rèn)為是最主要的因素。研究表明，約50%的胚胎停育絨毛組織存在染色體異常［5］。G 顯帶核型分析或免疫熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是絨毛組織染色體異常檢測(cè)的常用手段，但兩種技術(shù)都有一定的局限性。G 顯帶核型分析需要細(xì)胞培養(yǎng)且只能檢出染色體數(shù)目或大片段的結(jié)構(gòu)異常，F(xiàn)ISH 則只能檢測(cè)有限的染色體數(shù)目異常，會(huì)漏檢一些染色體異常。近幾年發(fā)展起來的染色體微陣列技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA），只需獲得DNA，就可全面、快速的檢出全部染色體的數(shù)目異常及非平衡性結(jié)構(gòu)異常，即染色體片段的缺失或重復(fù)，也稱為拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）。本研究基于CMA 分析胚胎停育絨毛組織的染色體異常，不僅分析了以往檢測(cè)技術(shù)能檢出的染色體數(shù)目異常和大片段結(jié)構(gòu)異常，還分析了小片段的CNV，以及其他罕見的染色體異常類型，更全面的研究了胚胎停育和染色體異常的關(guān)系，進(jìn)一步分析了孕婦年齡、流產(chǎn)次數(shù)差異，包含拷貝數(shù)在內(nèi)的染色體異常分布情況。也進(jìn)一步探討CMA 在胚胎停育遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年10月至2020年5月在本院確診為胚胎停育（包括自然流產(chǎn)和稽留流產(chǎn)），并行清宮術(shù)及絨毛組織染色體異常檢測(cè)的自然受孕孕婦324 例。孕婦年齡為20～43 歲，平均（30±4）歲，孕周6～14 周。患有子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等影響胚胎著床、發(fā)育的，以及男方精子不成熟的胚胎停育患者不納入研究。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018 倫函審［011］號(hào)），所有受檢者均已簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集及DNA 提取將新鮮絨毛組織標(biāo)本浸泡在裝有無菌等滲氯化鈉溶液離心管內(nèi)，并用大量等滲氯化鈉溶液清洗3 次，去除血液等雜物。用組織剪取少部分絨毛組織，并將其剪碎。使用Promega 公司（美國）DNA 提取試劑盒，按照說明書提取基因組DNA。用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度。

1.3 染色體微陣列檢測(cè)使用Thermo fisher 公司（美國）CytoScanTMOptima 芯片，按試劑盒說明書操作，將基因組DNA 經(jīng)酶切、接頭連接、PCR、產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記、預(yù)雜交之后，雜交液注入芯片，進(jìn)行過夜雜交。次日，芯片經(jīng)洗滌、染色和掃描獲得數(shù)據(jù)，用ChAS 軟件分析。將基因組拷貝數(shù)變異與收錄正常人群拷貝數(shù)變異的DGV 數(shù)據(jù)庫（http：//projects.tcag.ca/variationriatio）比對(duì)，并查詢表型數(shù)據(jù)庫DECIPHER（https：//decipher.sanger.ac.uk/）、ClinGene、PUBMED 數(shù)據(jù)庫等，并參考2019年CNV 解讀標(biāo)準(zhǔn)［6］進(jìn)行解讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用（）表示；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絨毛組織染色體異常檢出率共收集324 例絨毛組織，采用染色體微整列分析法檢測(cè)100%成功，檢出異常199 例，異常總檢出率為61.42%。其中，染色體數(shù)目異常172 例，檢出率為53.09%。CNV 21例，檢出率為6.48%。其他異常6例，檢出率為1.85%。199 例異常病例中，染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常分別占比86.43%和10.55%。染色體數(shù)目異常以常染色體三體最多（126/199，63.32%）。常染色體三體包含了多重三體6 例、嵌合體三體7 例、嵌合體多重三體2 例。6 例其他異常，包括染色體三體和CNV 合并異常2 例，三倍體基礎(chǔ)上的非整倍體2 例（68，XYY，-4 和70，XXX，+16），雜合性缺失（LOH）1 例，異源嵌合（46.XX/46，XY）1 例，異常占比為3.02%。見表1。

表1 胚胎停育絨毛組織染色體異常檢出情況Tab.1 Detection of chromosomal abnormalities in fetal villous tissue of embryo damage

2.2 染色體非整倍體分析常染色體三體、常染色體單體、性染色體單體和合并三體和結(jié)構(gòu)異常的病例共159 例，均屬于染色體非整倍體。分析這些非整倍體異常中每條染色體的發(fā)生異常的頻率，見表2。常染色體多數(shù)以三體發(fā)生常見，少數(shù)發(fā)生單體。其中，16-三體發(fā)生率最高為23.90%（38/159），其次為22-三體（19/159，11.95%）、15-三體（17/159，10.69%）和21-三體（14/159，8.8%）等。性染色體異常以X 單體為常見，發(fā)生率為17.61%（28/159）。本次收集的樣本中，有19 條出現(xiàn)了非整倍體異常，1、17、19 號(hào)常染色體和Y 染色體未發(fā)現(xiàn)非整倍體異常。

2.3 低齡孕婦與高齡孕婦染色體異常分布將樣本以預(yù)產(chǎn)年齡35 歲為界限分為低齡組和高齡組來分析。324 例樣本中，低齡組孕婦275 例，平均年齡（29±2）歲，染色體異常164 例；高齡組孕婦49 例，平均年齡（37±2）歲，染色體異常35 例；異常率分別為59.64%和71.43%，高齡組異常率高于低齡組，但兩組染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.441，P=0.118）。比較不同類型染色體異常的分布差異，兩組間常染色體三體（χ2=14.450，P＜0.001）和CNV（χ2=5.010，P=0.025），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。染色體三體在高齡組異常占比高達(dá)91.43%，低齡組中為57.32%；CNV 在低齡組中異常占比12.80%，高齡組異常中未發(fā)現(xiàn)。常染色體單體、性染色體單體和三倍體在低齡組中分布率均高于高齡組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各染色體三體在高齡組和低齡組中的分布見圖1，13、15、21、22 號(hào)染色體在高齡組三體異常占比更高，而16-三體在低齡組占比更高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

表2 各染色體非整倍體異常發(fā)生頻次Tab.2 The frequency of aneuploid abnormality of each chromosome

表3 高齡孕婦與低齡孕婦染色體異常分布情況Tab.3 Distribution of chromosomal abnormalities in older and younger pregnant women 例（%）

圖1 高齡孕婦與低齡孕婦常染色體三體的分布情況Fig.1 Distribution of autosomal trisomy in older and younger pregnant women

2.4 多次胚胎停育染色體異常情況324 例樣本中有4 例胚胎停育≥2 次，其中3 例異常，且均為常染色體三體，異常率75%；與單次胚胎停育的染色體異常率（196/320，61.25%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 胚胎停育樣本中發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)變異共檢出21 例CNV，通過查詢數(shù)據(jù)庫判斷其致病性，其中16 例為致病性，3 例為可能致病，2 例為臨床意義未明。21 例中有10 例同時(shí)發(fā)生兩個(gè)或兩個(gè)以上位點(diǎn)的CNV。同一病例具有多個(gè)致病性不同的CNV 時(shí)，以致病性最強(qiáng)的作為評(píng)價(jià)。按片段長度來分析，有12 例（57.14%）CNV＞10 Mb，全部為致病性變異；2 例（9.52%）CNV 大小在5～10 Mb 之間，為可能致病變異；7 例（33.33%）CNV＜5 Mb，4 例為致病性變異，1 例為可能致病變異。大部分CNV 有與之相關(guān)連的疾病報(bào)道，這些疾病可導(dǎo)致多種發(fā)育問題。21 例病例均未收集到其父母驗(yàn)證結(jié)果。見表4。

3 討論

胚胎停育是婦產(chǎn)科常見疾病，以自然流產(chǎn)或稽留流產(chǎn)為妊娠結(jié)局。胚胎停育病因多而復(fù)雜，其中染色體異常是公認(rèn)的最主要的致病因素。流產(chǎn)組織絨毛染色體的檢測(cè)，是尋找胚胎停育病因的有效手段，不僅能夠?yàn)樯щy患者提供遺傳指導(dǎo)，還有助于推動(dòng)流產(chǎn)病理學(xué)的臨床研究。本研究分析324 例胚胎停育絨毛組織樣本，顯示染色體異常率為61.42%，較大多數(shù)早期自然流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)等胚胎停育相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的異常率（50%～70%）［4-5，7-10］偏高。這一結(jié)果說明約60%的胚胎停育病例可以在遺傳方面找到病因，根據(jù)具體的染色體異常將得到有效的生育指導(dǎo)。

表4 胚胎停育絨毛組織中發(fā)現(xiàn)的CNVTab.4 The CNVs found in aborted villous tissue of embryo damage

一般染色體異常分為數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。數(shù)目異常是臨床上最常見的染色體畸變類型。胚胎停育染色體異常研究報(bào)道中染色體數(shù)目畸變的異常占比普遍可達(dá)90%左右，其中非整倍體三體最多，可達(dá)60%以上［5，8-10］，本研究的檢出率與之相似。非整倍體主要是由卵母細(xì)胞或精子成熟過程中或受精卵早期卵裂過程中染色體不分離或丟失造成的［11］。通常來說，三體最常見且種類最多。除了1 號(hào)染色體外，所有染色體的三體都在流產(chǎn)組織中被發(fā)現(xiàn)［5］，本研究中1、17、19 號(hào)染色體未發(fā)現(xiàn)三體。一般16-三體的發(fā)生率最高，在自然流產(chǎn)的染色體三體病例中約占20%～30%［5，8-9］。16-三體與胎兒死亡、早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和胎兒畸形高度相關(guān)［12］。發(fā)生率較高的還包括22-三體、21-三體和15-三體，13-三體和18-三體發(fā)生率也相對(duì)較高但低于前述4 條染色體［5，8-10］。本研究中，各染色體異常頻次統(tǒng)計(jì)顯示16-三體發(fā)生頻次最高，其次為22、15、21、13-三體，但并未發(fā)現(xiàn)18-三體。Turner 綜合征（45，XO）是性染色體數(shù)目異常最常見的類型［8-10］，本研究檢出率較其他文獻(xiàn)報(bào)道稍高，同時(shí)并未見其他種類的性染色體異常。但事實(shí)上47，XXX、47，XXY、47，XYY 和47，XYYY 在流產(chǎn)絨毛組織中也可被檢測(cè)到［9-10］。常染色體單體發(fā)生率一般較低，本研究偶見18 單體兩例和21 單體1 例。整倍性異常也常見于流產(chǎn)絨毛組織中［8-10］，可發(fā)生三倍體或四倍體，本研究采用方法僅可檢出三倍體。三倍體是致死性的，其形成可能來自于雙雌受精或雙雄受精。雙雌受精是指二倍體卵細(xì)胞的受精，通常是由于卵細(xì)胞未排出極體或第二極體重新融合到卵細(xì)胞；雙雄受精即兩個(gè)精子同時(shí)進(jìn)入了卵細(xì)胞［13］。多倍體的發(fā)生率遠(yuǎn)低于非整倍體，這可能與兩類異常發(fā)生的機(jī)制不同有關(guān)。

染色體結(jié)構(gòu)異常包括染色體片段的重復(fù)、缺失、倒位和易位，在流產(chǎn)組織染色體總體異常中所占的比例約為5%～13%［8-10］，本研究檢出為10.55%。結(jié)構(gòu)異常的檢出率受到檢測(cè)方法的影響，一般CMA方法檢出率高于傳統(tǒng)核型分析。常規(guī)染色體核型分析僅能發(fā)現(xiàn)＞5～10 Mb 片段的結(jié)構(gòu)異常，而CMA 能檢出染色體微小片段（＞100 Kb）的缺失或重復(fù)，但無法檢出平衡易位或倒位等無DNA 片段缺失或重復(fù)的染色體結(jié)構(gòu)異常。本研究檢出的21 例結(jié)構(gòu)異常，有7 例缺失或重復(fù)的片段＜5 Mb，有4例含有5～10 Mb的片段，這些是常規(guī)核型分析方法不能或不易發(fā)現(xiàn)的。基于本研究檢測(cè)結(jié)果，在流產(chǎn)組織中CMA 至少能比傳統(tǒng)方法多檢出33.33%（7/21）的染色體結(jié)構(gòu)異常。本研究中發(fā)現(xiàn)的流產(chǎn)絨毛組織的染色體片結(jié)構(gòu)異常多數(shù)同時(shí)存在重復(fù)和缺失，且發(fā)生在不同的染色上，形成多重結(jié)構(gòu)異常。根據(jù)2019年新版CNV 解讀標(biāo)準(zhǔn)［6］，較大片段的缺失重復(fù)評(píng)分均＞0.99，可以認(rèn)定其為明確的致病性變異，但本研究中也有5 例可能致病或臨床意義不明的小片段缺失或重復(fù)病例，需要未來臨床數(shù)據(jù)的進(jìn)一步積累或相關(guān)基因功能的研究來提供證據(jù)明確其致病性。

胚胎停育涉及到的染色體異常類型復(fù)雜，這些異常包括但不限于染色體三體、單體、多倍體、染色體嵌合、染色體結(jié)構(gòu)重排列及拷貝數(shù)變異等［14］。同一病例攜多重染色體異常的情況并不少見［8-10］，如本研究中發(fā)現(xiàn)的多重三體、三體合并CNV 異常、三倍體非整倍體。此外，LOH 也是胚胎停育的致病原因［15-16］，但較少見，本研究發(fā)現(xiàn)1 例。本研究還發(fā)現(xiàn)1 例46，XX/46，XY 異源嵌合，也稱真兩性畸形或開米拉。根據(jù)文獻(xiàn)資料及本研究的分析結(jié)果，使用CMA 方法更大程度上的找出了胚胎停育的遺傳學(xué)病因。CMA 檢測(cè)胚胎停育的病因需要更多的臨床研究來補(bǔ)充積累，有廣闊的發(fā)展和創(chuàng)新空間。

隨著年齡的增加，女性的流產(chǎn)次數(shù)及其胎兒染色體異常率都會(huì)隨之增高［17］。本研究發(fā)現(xiàn)高齡組的染色體異常率（71.43%）遠(yuǎn)高于低齡組（59.64%），差異主要表現(xiàn)在常染色體三體和CNV 異常上。高齡組的三體比率可達(dá)90%。Soler 等在980 例自然流產(chǎn)組織中分析母親年齡與染色體異常的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高齡孕婦中染色體異常率顯著高于低齡孕婦，異常率從61.3%增加至76.8%［18］。本研究進(jìn)一步分析了各染色體三體在高、低齡孕婦中的分布，但這可能受到樣本量的限制，因此差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中CNV 異常在低齡孕婦的染色體異常占比較高，而高齡孕婦中未見此類異常。ZHANG 等［19］報(bào)道在胎兒或流產(chǎn)組織中，非整倍體和CNV 的發(fā)生率隨孕婦年齡的增加而增加。按照一般的認(rèn)識(shí)孕婦年齡越大發(fā)生染色體異常機(jī)率越高，推測(cè)本研究與文獻(xiàn)結(jié)果相異的主要原因可能是高齡組樣本量少，這還需要更大樣本量的研究來驗(yàn)證。LEI 等［20］發(fā)現(xiàn)孕婦年齡越高，胎兒羊水染色體核型45，X 的發(fā)生率反而越低。本研究發(fā)現(xiàn)45，X 的發(fā)生率同樣是在低齡孕婦中更高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除三體和CNV 異常外的其他幾種染色體異常在高齡和低齡比較中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能和高齡組樣本量的較少有關(guān)，還需要后期再擴(kuò)大樣本數(shù)進(jìn)行研究，使結(jié)果更具有可靠性。

偶發(fā)性流產(chǎn)在早孕期是常見的，但連續(xù)兩到三次的反復(fù)妊娠損失的現(xiàn)象并不常見。一些研究稱偶發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)流產(chǎn)其妊娠產(chǎn)物的染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［21］。但也有一些研究聲明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的染色體異常率要低于偶發(fā)性流產(chǎn)［5］，因?yàn)榕及l(fā)性流產(chǎn)可認(rèn)為主要是異常胚胎向生存能力發(fā)展的失敗，與染色體異常關(guān)聯(lián)更為密切，而復(fù)發(fā)性流產(chǎn)包含更多的其他病因。綜合多個(gè)研究結(jié)果，反復(fù)流產(chǎn)的染色體異常率與自然流產(chǎn)的異常率相似［21-22］。ZHANG 等［23］研究了696 例流產(chǎn)患者反復(fù)流產(chǎn)的病因構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)兩次或三次以上復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因構(gòu)成一致。本研究分析顯示單次與多次胚胎停育染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但因多次胚胎停育樣本量較少，所以此次分析結(jié)果并不能充分說明多次胚胎停育與單次胚胎停育染色體異常的差異，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，通過染色體檢測(cè)可為半數(shù)以上的胚胎停育患者找到病因，除了最常見的染色體數(shù)目異常，CNV 也是一個(gè)重要的致病原因。CMA 作為新興的分子核型分析技術(shù)，能更高效且準(zhǔn)確地分析胚胎停育組織染色體的數(shù)目和非平衡結(jié)構(gòu)變異，檢出傳統(tǒng)染色體診斷技術(shù)無法檢測(cè)到的微缺失微重復(fù)，提高染色體異常的檢出率。未來應(yīng)該繼續(xù)研究CMA 對(duì)胚胎停育中染色體結(jié)構(gòu)異常的檢出率，并積累致病CNV 的數(shù)據(jù)，為臨床提供更加準(zhǔn)確和豐富的參考。總之，CMA 技術(shù)的應(yīng)用有利于胚胎停育的臨床診斷和指導(dǎo)患者再生育，提高了臨床染色體病的診斷水平。