李京洋 保森竹 姚毅章 黃文泉

1青海省第五人民醫(yī)院/青海省腫瘤醫(yī)院（西寧810000）；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院（西寧810000）；3江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（南昌330006）

舌鱗狀細(xì)胞癌（TSCC）是一種以上皮來源為主的中分化鱗癌或高分化鱗癌，是最常見的口腔惡性腫瘤［1］。TSCC 的臨床表現(xiàn)主要為語音、咀嚼和吞咽方面的功能障礙，疾病后期往往發(fā)生局部或區(qū)域性復(fù)發(fā)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［2］。針對(duì)TSCC，目前尚無特效治療方法，主要以單純手術(shù)治療、放射治療、全身化療和靶向治療為主要方向［3-4］。miR-149 以其廣泛參與生物學(xué)調(diào)控、在各種腫瘤中表達(dá)均異常等特點(diǎn)已然成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的新方向和新思路。但是目前關(guān)于miR-149 的報(bào)道主要集中在膀胱癌、食管癌和骨肉瘤細(xì)胞等方面，對(duì)于miR-149 對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的影響和機(jī)制方面缺乏系統(tǒng)報(bào)道［5-8］。本研究旨在探討miR-149通過BMP/Smad 信號(hào)通路對(duì)TSCC 細(xì)胞增殖侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113（Procell，CL-0230）、人舌鱗癌細(xì)胞CAL-27（Procell，CL-0265）。

1.2 主要儀器和試劑miR-149 qRT-PCR 試劑盒（TransScript，AQ202-01）、細(xì)胞增殖檢測試劑盒（聯(lián)科生物，CP001）、BMP-2 抗體（BioVision，5672-100）、Anti-SMAD1/3/5 抗體（abcam，ab118825）、Anti-SMAD1/5/8/9 抗體（子起生物，PA141079）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（力康）、PCR 儀（Thermo）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法采用熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)測定miR-149 在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞（Tca8113 和CAL-27）中的mRNA 表達(dá)，miR-149 的引物設(shè)計(jì)如表1所示［9］。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒在細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí)轉(zhuǎn)入Tca8113 和CAL-27 細(xì)胞，分別分為miR-149-con 組和miR-149-mim 組（20 pmol Con-mimic/miR-149-mimic 質(zhì)粒+Lipofectamine 1 μL）［10］，采用MTT法檢測miR-149 過表達(dá)對(duì)Tca8113 和CAL-27 細(xì)胞增殖的影響；采用Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-149 過表達(dá)對(duì)Tca8113 和CAL-27 細(xì)胞侵襲的影響；采用Western blot 檢測BMP/Smad 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量。

表1 miR-149 引物設(shè)計(jì)Tab.1 miR-149 primer design

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)分析兩組間差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-149在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的表達(dá)情況由圖1可知，CAL-27 和Tac8113細(xì)胞中的miR-149 mRNA表達(dá)水平相較ATCC細(xì)胞顯著下調(diào)（t=3.562、3.642，P＜0.05）；CAL-27 和Tac8113 細(xì)胞中miR-149-mim 組的miR-149 mRNA 表達(dá)水平相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（t=9.535、9.672，P＜0.01）。

2.2 miR-149對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響由圖2可知，miR-149-con組和miR-149-mim組CAL-27細(xì)胞增殖速度分別為（101.13±24.22）%、（75.41±14.56）%，故miR-149-mim 組CAL-27 細(xì)胞增殖速度相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（t=3.322，P＜0.05）；miR-149-con組和miR-149-mim組Tac8113細(xì)胞增殖速度分別為（101.83±27.16）%、（73.25±16.25）%，故miR-149-mim 組Tac8113 細(xì)胞增殖速度相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（t=3.354，P＜0.05）。

圖1 miR-149 在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-149 in tongue squamous cell carcinoma

圖2 miR-149 對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of miR-149 on the proliferation of tongue squamous cell carcinoma cells

2.3 miR-149 對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響由圖3可知，miR-149-con 組和miR-149-mim 組CAL-27侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為（71.58±7.36）、（19.23±3.82），故miR-149-mim 組的CAL-27 細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（t=3.884，P＜0.05）；miR-149-con 組和miR-149-mim 組Tac8113 細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)分別為（77.49±9.11）、（24.15±3.89），故miR-149-mim 組Tac8113 細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（t=3.892，P＜0.05）。

圖3 miR-149 對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響Fig.3 Effect of miR-149 on the invasion of tongue squamous cell carcinoma

2.4 BMP/Smad 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平由圖4可知，miR-149-mim 組的CAL-27 細(xì)胞BMP-2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8 表達(dá)水平相較miR-149-con組顯著下調(diào)（t=3.225、3.188、3.354，P＜0.05）。miR-149-mim 組的TAC8113 細(xì)胞BMP-2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8 表達(dá)水平相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（t=3.243、3.196、3.368，P＜0.05）。

圖4 BMP/Smad 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression level of proteins related to BMP/Smad signal pathway

3 討論

本研究以Tca8113 和CAL-27 作為考查對(duì)象，分別分為miR-149-con 組和miR-149-mim 組，研究miR-149通過BMP/Smad信號(hào)通路對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖侵襲的影響。熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAL-27 細(xì)胞中的miR-149 mRNA 表達(dá)水平相較ATCC 細(xì)胞顯著下調(diào)（P＜0.05）；Tac8113 細(xì)胞中的miR-149 mRNA 表達(dá)水平相較ATCC 細(xì)胞顯著下調(diào)（P＜0.05）；miR-149-mim 組CAL-27 細(xì)胞miR-149 mRNA 表達(dá)水平相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（P＜0.01）；miR-149-mim 組Tac8113 細(xì)胞miR-149 mRNA 表達(dá)水平相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（P＜0.01）。MTT 法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-149-mim 組CAL-27細(xì)胞增殖速度相較miR-149-con組顯著下調(diào)（P＜0.05）；miR-149-mim 組Tac8113 細(xì)胞增殖速度相較miR-149-con組顯著下調(diào)（P＜0.05）。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-149-mim 組的CAL-27細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)相較miR-149-con組顯著下調(diào)（P＜0.05）；miR-149-mim 組Tac8113 細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（P＜0.05）。Western blot 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-149-mim 組的CAL-27 細(xì)胞BMP-2 表達(dá)水平、Smad1/5/8 表達(dá)水平和p-Smad1/5/8表達(dá)水平相較miR-149-con組顯著下調(diào)（P＜0.05）；miR-149-mim 組的TAC8113 細(xì)胞BMP-2、Smad1/5/8和p-Smad1/5/8 表達(dá)水平相較miR-149-con 組顯著下調(diào)（P＜0.05），說明miR-249 對(duì)Tca8113 和CAL-27 增殖和侵襲的影響與激活BMP/Smad 信號(hào)通路有關(guān)。

TSCC 惡性程度高，生長快，浸潤性強(qiáng)，且早期易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［11］。CHEN 等［12］研究異嗜性和多性逆轉(zhuǎn)錄病毒受體1（XPR1）發(fā)現(xiàn)，與正常舌頭組織相比，TSCC 組織中的XPR1 明顯上調(diào)。XPR1的高表達(dá)與TSCC的惡性特征和較差的患者存活率顯著相關(guān)。XPR1 的異位表達(dá)增加，而XPR1 的沉默則降低TSCC 細(xì)胞的增殖、侵襲和抗凋亡能力。YANG 等［13］研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)周浸潤（PNI）是TSCC、口腔癌的不良預(yù)后因素。在控制T 期和病理分化后，PNI 仍然是宮頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（CLNM）、局部復(fù)發(fā)、頸部復(fù)發(fā)和疾病特異性生存（DSS）的獨(dú)立預(yù)測因子。END 也不能改善PNI 患者的頸部控制或DSS。REN 等［14］研究發(fā)現(xiàn)TSCC 細(xì)胞系和組織中長非編碼RNA 在大腸癌的差異表達(dá)（CRNDE）上調(diào)。CRNDE 的過表達(dá)增加了TSCC 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞侵襲。此外，CRNDE 的異位表達(dá)抑制了SCC1 細(xì)胞中miR-384 的表達(dá)，并增加了Kirsten Ras（KRAS），細(xì)胞分裂周期42 和胰島素受體底物1的表達(dá)，這是miR-384 的直接靶基因。與配對(duì)的相鄰非腫瘤樣品相比，TSCC 樣品中的miR-384 表達(dá)下調(diào)。SHI 等［15-17］研究發(fā)現(xiàn)TSCC 組織和細(xì)胞系中miR-488 的水平顯著降低，而ATF3 的表達(dá)顯著提高。引入miR-488 可以顯著抑制TSCC 細(xì)胞的侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），而敲低miR-488 則可以促進(jìn)這兩個(gè)過程。ATF3 是miR-488 的潛在靶基因且miR-488 可以直接靶向ATF3。ATF3 沉默與miR-488 在TSCC 細(xì)胞上的過表達(dá)具有相似的作用。TSCC 細(xì)胞中ATF3 的過度表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-488 模擬物的抑制作用。miR-488通過直接下調(diào)ATF3表達(dá)來抑制TSCC細(xì)胞的侵襲和EMT。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示過表達(dá)miR-149可以通過激活BMP/Smad 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)TSCC細(xì)胞增殖侵襲的抑制作用。研究尚存在不足之處：本研究并未對(duì)miR-149 調(diào)控BMP/Smad 信號(hào)通路介導(dǎo)TSCC 細(xì)胞生物學(xué)行為變化過程中涉及的具體細(xì)胞因子、靶基因以及機(jī)制進(jìn)行具體分析，此外miR-149 對(duì)TSCC 細(xì)胞周期的影響仍需要進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的深入研究。