劉彤 銀維謀 藍(lán)嬌 龍勝澤 覃松梅 韋彩周 韋碧妙李鳳獻(xiàn) 羅凌 覃雪軍

1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（南寧530021）；2廣西柳州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（廣西柳州545006）

支氣管哮喘是一種病因復(fù)雜的慢性非特異性炎癥。淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡在支氣管哮喘的發(fā)病中擔(dān)任著重要角色。既往研究提示，支氣管哮喘發(fā)病除了受輔助性T 細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）/輔助性T 細(xì)胞2（T helper cell 2，Th2）失衡影響外，還與調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）/輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）細(xì)胞的失衡有關(guān)［1-2］。但是，目前對(duì)于Treg/Th17細(xì)胞免疫失衡在哮喘中的作用機(jī)制尚不明確。CCR4/TARC信號(hào)軸在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、胸腔積液患者Foxp3+Treg向胸腔募集等均起到調(diào)控作用［3］。而Treg 和Th17表面 均 存在CCR4 表 達(dá)，TARC 又 是CCR4 的特 異性配體之一［4］。在支氣管哮喘中，CCR4/TARC 信號(hào)軸是否參與了Treg/Th17 細(xì)胞平衡的調(diào)控對(duì)于加深對(duì)支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的了解有著重要意義。為了進(jìn)一步明確CCR4/TARC 信號(hào)軸、Treg/Th17 細(xì)胞平衡與支氣管哮喘炎癥之間關(guān)聯(lián)，本研究通過(guò)建立哮喘小鼠模型對(duì)此進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)BALB/C 雌性小鼠20 只作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有小鼠均被飼養(yǎng)在SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)驗(yàn)室，其喂養(yǎng)飼料均接受過(guò)無(wú)菌處理，且飼料成分中不含卵清蛋白（ovablumin，OVA）。按簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法，20 只雌性BALB/C 小鼠分為哮喘組10 只（1 只小鼠因出現(xiàn)呼吸抑制死亡）和對(duì)照組（10 只），分籠飼養(yǎng)。兩組小鼠的周齡均為6～7 周，體重18～22 g，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠致敏于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第0 天、第7 天及第14 天分別進(jìn)行3 次致敏，方法如下：給每只哮喘組小鼠進(jìn)行局部皮膚碘伏消毒，然后腹腔注射OVA 致敏混懸液0.2 mL，其中包含有OVA 25 μg 和氫氧化鋁凝膠0.1 mL。對(duì)照組小鼠則注射同等劑量的1×PBS。

1.2.2 小鼠激發(fā)從實(shí)驗(yàn)第21 天開(kāi)始進(jìn)行小鼠激發(fā)，每天1 次，連續(xù)7 d。方法如下：首先應(yīng)用碘伏對(duì)哮喘組小鼠進(jìn)行局部皮膚消毒，然后自腹腔向小鼠注射1%戊巴比妥鈉混合液完成麻醉，注射劑量為45 mg/kg，再用OVA 溶液40 μL 進(jìn)行滴鼻。對(duì)照組則進(jìn)行同等量1×PBS 滴鼻。

1.2.3 樣本采集兩組小鼠均在最后1 次激發(fā)后處死，然后采集小鼠外周血、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），進(jìn)行離心分離進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，并分離肺組織，提取淋巴細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。

1.3 觀察指標(biāo)（1）比較兩組小鼠肺組織病理學(xué)改變。（2）比較兩組小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴細(xì)胞的占比、CCR4 在Treg 和Th17 中的表達(dá)水平。（3）比較兩組小鼠BALF 中白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）和TARC 濃度。（4）分析肺組織炎癥評(píng)分與BALF 中TARC 的相關(guān)性及哮喘組肺內(nèi)Th17 細(xì)胞的比例變化與BALF 中TARC 濃度的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變 哮喘組小鼠支氣管黏膜、基底膜、肺間質(zhì)和肺泡壁均增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，支氣管及血管周?chē)霈F(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組無(wú)此改變。

2.2 兩組小鼠支氣管及其周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分比較哮喘組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠支氣管及其周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分比較Tab.1 Comparison of inflammatory cell infiltration scores in bronchus and surrounding areas between the two groups 例（%）

2.3 兩組小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴細(xì)胞的占比比較哮喘組小鼠肺內(nèi)、外周血中的Treg 細(xì)胞在CD4+T 淋巴細(xì)胞占比低于對(duì)照組，哮喘組小鼠肺內(nèi)、外周血Th17 細(xì)胞在CD4+T 淋巴細(xì)胞的在高于對(duì)照組，哮喘組肺內(nèi)、外周血中的Treg/Th17細(xì)胞比值顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

表2 肺組織淋巴細(xì)胞Treg、Thl7 百分比檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of Treg and Thl7 percentages of lymphocytes in lung tissue ±s

表2 肺組織淋巴細(xì)胞Treg、Thl7 百分比檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of Treg and Thl7 percentages of lymphocytes in lung tissue ±s

組別哮喘組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)9 10 CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞（%）4.54±2.68 11.54±1.8 1.550＜0.001 CD4+IL-17+T 細(xì)胞（%）2.58±0.43 0.76±0.15 7.873＜0.001 Treg/th17 細(xì)胞1.88±1.31 15.35±2.30 4.178＜0.001

表3 外周血淋巴細(xì)胞Treg、Thl7 百分比檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection results of Treg and Thl7 percentages of peripheral blood lymphocytes ±s

表3 外周血淋巴細(xì)胞Treg、Thl7 百分比檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection results of Treg and Thl7 percentages of peripheral blood lymphocytes ±s

組別哮喘組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)9 10 CD4+CD25+Foxp3+ T 細(xì)胞（%）3.73±0.58 10.05±2.43 2.294＜0.001 CD4+IL-17+T 細(xì)胞（%）2.12±0.69 0.93±0.41 3.009 0.001 Treg/th17 細(xì)胞1.95±1.34 13.43±7.65 14.530＜0.001

2.4 兩組小鼠CCR4 在Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞中的表達(dá)比較哮喘組肺內(nèi)、外周血中的CCR4 在Treg、Th17 細(xì)胞中的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 CCR4 表達(dá)Fig.1 Expression results of CCR4

2.5 兩組小鼠血清和BALF 中IL-17A和TARC 濃度比較兩組小鼠IL-17A 在血清和BALF 中的濃度均呈低水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組小鼠血清中TARC 的濃度均呈低水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；哮喘組小鼠BALF 中TARC 的濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4、5。

表4 兩組小鼠血清中和BALF 中IL-17A 的濃度Tab.4 Concentrations of IL-17A in serum and BALF of mice in two groups ±s

表4 兩組小鼠血清中和BALF 中IL-17A 的濃度Tab.4 Concentrations of IL-17A in serum and BALF of mice in two groups ±s

組別哮喘組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)9 10血清中IL-17A的濃度（pg/mL）7.19±0.01 7.20±0.03 0.994 0.796 BALF 中IL-17A的濃度（pg/mL）7.46±0.43 7.24±0.07 1.516 0.934

表5 兩組小鼠血清中和BALF 中TARC 的濃度Tab.5 Concentration of TARC in serum and BALF of two groups of mice ±s

表5 兩組小鼠血清中和BALF 中TARC 的濃度Tab.5 Concentration of TARC in serum and BALF of two groups of mice ±s

組別哮喘組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)9 10血清中TARC的濃度（pg/mL）21.96±6.44 22.15±4.54 0.073 0.713 BALF 中TARC的濃度（pg/mL）108.27±62.16 41.07±18.95 2.137 0.006

2.6 哮喘組肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分與BALF 內(nèi)TARC 濃度的相關(guān)性哮喘組肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分與BALF 內(nèi)TARC 濃度呈正相關(guān)（r=0.673，P＜0.05）。

2.7 哮喘組肺內(nèi)Th17細(xì)胞與BALF內(nèi)TARC濃度的相關(guān)性分析哮喘組肺內(nèi)Th17 細(xì)胞與BALF 內(nèi)TARC 濃度呈正相關(guān)（r=0.586，P＜0.05）。

3 討論

既往研究認(rèn)為，支氣管哮喘的發(fā)病主要是因Th1/Th2細(xì)胞比例失衡所致［5-6］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Treg 數(shù)目變化或功能缺陷與支氣管哮喘氣道炎癥有關(guān)，而Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞的關(guān)系密切［7-9］。Th17/Treg 細(xì)胞比例失衡與哮喘的炎癥反應(yīng)的相關(guān)性已被研究證實(shí)，但其具體作用機(jī)制以及受何種因素影響尚不清楚。明確Treg/Th17 細(xì)胞失衡的作用機(jī)制以及其所受調(diào)控因素對(duì)支氣管哮喘的診療有著重要意義。

Treg 特異性表達(dá)CD25 及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 能夠介導(dǎo)機(jī)體免疫功能，抑制CD4+CD25-T 淋巴細(xì)胞的表達(dá)，還能對(duì)Th1 與Th2 細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，影響T 淋巴細(xì)胞的分化。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，Treg能夠通過(guò)介導(dǎo)Th2 細(xì)胞減輕氣道對(duì)過(guò)敏原的反應(yīng)，進(jìn)而緩解哮喘氣道炎癥［10-11］。Th17細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生IL-17A 等細(xì)胞因子，而其分化又受到TGF-β、IL-6、IL-23 等因子調(diào)節(jié)。TGF-β和視黃酸呈高表達(dá)會(huì)促進(jìn)Treg 的分化，TGF-β、IL-6 及IL-1β呈低表達(dá)則會(huì)對(duì)Th17 的分化起到促進(jìn)作用［12］。由此可知，Treg與Th17 細(xì)胞在功能方面具有拮抗作用，通常情況下二者保持著一定的平衡，維持著機(jī)體功能正常作用。但一旦這種平衡被破壞，則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫受損，引發(fā)免疫相關(guān)疾病［13-14］。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)哮喘小鼠模型肺內(nèi)和外周血中的Treg、Th17 細(xì)胞在CD4+T 淋巴細(xì)胞中所占比例進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：哮喘小鼠的Treg 無(wú)論是在肺內(nèi)還是在外周血中的濃度比無(wú)哮喘小鼠均更低，而肺內(nèi)和外周血的Th17 細(xì)胞濃度較無(wú)哮喘小鼠則明顯更高；哮喘小鼠在肺內(nèi)和外周血中的Treg/Th17 細(xì)胞比值與無(wú)哮喘小鼠比較則出現(xiàn)明顯下降。在機(jī)體自身狀態(tài)穩(wěn)定、無(wú)損傷時(shí)，免疫系統(tǒng)的TGF-β始終處于低水平。少量的TGF-β可誘導(dǎo)初始T 細(xì)胞分化出Treg 細(xì)胞，Treg/Th17 細(xì)胞比值處于平衡狀態(tài)。TGF-β水平較低時(shí)，其分化作用也相對(duì)較弱。但在機(jī)體有炎癥損傷的情況下，免疫系統(tǒng)則釋放出大量TGF-β、IL-6 等細(xì)胞因子，導(dǎo)致Th17 細(xì)胞分化作用大幅增強(qiáng)，導(dǎo)致Th17 濃度上升，打破Treg和Th17 平衡，引發(fā)Treg/Th17 細(xì)胞比值變化。由此可見(jiàn)，哮喘氣道炎癥與Treg/Th17 細(xì)胞比值在肺內(nèi)和外周血中的失衡有密切關(guān)聯(lián)，與既往研究一致［11-13］。

Treg 和Th17 表面都存在CCR4 表達(dá)，TARC 又是CCR4 的特異性配體。已有研究表明，處于急性期的哮喘兒童TARC 水平異常升高［15-17］。因此推測(cè)CCR4/TARC信號(hào)軸也可能對(duì)Treg與Th17 之間平衡產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響炎癥發(fā)展。已有多項(xiàng)研究明確了CCR4/TARC 信號(hào)軸可在多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，如Foxp3+Treg 向胸腔募集、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等［18-20］。因此，CCR4/TARC 信號(hào)軸也可能通過(guò)調(diào)控Treg/Th17 細(xì)胞平衡而促進(jìn)炎癥向肺內(nèi)的浸潤(rùn)。本研究中，Treg 和Th17 細(xì)胞在哮喘組和正常小鼠的CCR4 中的表達(dá)水平均較高，且二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此提示CCR4/TARC 信號(hào)軸可對(duì)Treg 和Th17 細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，且調(diào)控效能無(wú)差異。IL-17A 在Th17 細(xì)胞中發(fā)揮著主要作用［21］。但本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠和正常小鼠IL-17A 在血清和BALF 中均呈低水平，且比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)此，推測(cè)原因可能是因?yàn)門(mén)h17 細(xì)胞比例雖增加但并未被激活，因此未起到介導(dǎo)炎癥的作用。而且Th17 在急性哮喘中并非通過(guò)IL-17A 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而是以IL-17F、IL-22 為主［22］。通過(guò)TARC的濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠血清中TARC 呈低水平，而在哮喘組BALF 中TARC 的濃度要高于正常小鼠，且兩組小鼠TARC 在BALF 內(nèi)的水平較血清中明顯更高。分析認(rèn)為，這可能是因?yàn)樾∈髿獾郎掀ぜ?xì)胞產(chǎn)生的TARC 導(dǎo)致了其在BALF內(nèi)的水平上升，也可能是氣道內(nèi)其他炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的TARC 導(dǎo)致了其水平升高。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肺組織肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分越高，BALF內(nèi)TARC濃度也越高，二者呈正相關(guān)；而且哮喘組肺內(nèi)Th17細(xì)胞的比例變化與BALF 內(nèi)TARC 的濃度變化呈正相關(guān)。由此得出，哮喘小鼠CCR4/TARC 信號(hào)軸通過(guò)調(diào)控Th17 細(xì)胞向肺組織的浸潤(rùn)。

綜上所述，Treg/Th17 細(xì)胞比值變化與哮喘肺內(nèi)炎癥的發(fā)生、發(fā)展有密切相關(guān)，而CCR4/TARC信號(hào)軸可能通過(guò)對(duì)Th17 的調(diào)控參與炎癥向肺內(nèi)的浸潤(rùn)。