鄭曉明 ， 劉瓊 ， 邵軍 ， 王娟麗 ， 朱凝 ， 趙靈智 ， 魏波 *

（1 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 廣東 廣州 510630； 2 華南師范大學(xué) 半導(dǎo)體科學(xué)與技術(shù)研究院， 廣東 廣州 510631）

胃癌、 結(jié)直腸癌均是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤， 每年新發(fā)病例數(shù)超過(guò)100 萬(wàn)， 且超過(guò)80%的病例已是中晚期， 每年死亡病例高達(dá) 70 萬(wàn)［1-2］， 因此胃癌、 結(jié)直腸癌的診斷和治療已成為亟待解決的問(wèn)題。 1987 年， 法國(guó)醫(yī)師Philippe M 完成了世界上首例腹腔鏡膽囊切除術(shù)， 標(biāo)志著微創(chuàng)手術(shù)時(shí)代的到來(lái)［3］。 多項(xiàng)相關(guān)研究［4-6］表明， 腹腔鏡手術(shù)在胃癌和結(jié)直腸癌患者預(yù)后及生存率方面與開(kāi)放手術(shù)沒(méi)有顯著差異。 然而， 腹腔鏡手術(shù)由于缺少外科醫(yī)師的觸感， 對(duì)于腫瘤及相關(guān)淋巴結(jié)的定位不及開(kāi)放性手術(shù)。 近年來(lái)， 近紅外熒光腹腔鏡及吲哚菁綠 （indocyanine green，ICG） 正逐漸應(yīng)用于臨床［7-8］， 可解決腹腔鏡對(duì)于腫瘤及相關(guān)淋巴結(jié)定位不夠準(zhǔn)確的問(wèn)題。 本研究就此建立動(dòng)物腫瘤模型，使用自主搭建的腹腔鏡系統(tǒng)對(duì)小鼠皮下腫瘤注射ICG 及其納米衍生物進(jìn)行驗(yàn)證， 探討熒光顯像的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象動(dòng)物造模： SPF 級(jí) 6 ～ 8 周齡的雌性 BALB／c 裸鼠若干， 體重 18 ～ 22 g， 自由進(jìn)食飲水。 籠具、 墊料、 飼料和水均經(jīng)高壓蒸汽滅菌， 并適時(shí)更換。 體外培養(yǎng)Hct116 腫瘤細(xì)胞系至對(duì)數(shù)期， 制成濃度約 2 × 107個(gè) ／mL 細(xì)胞懸液， 取 0.2 mL （4 × 106個(gè)） 注入裸鼠右側(cè)腋下， 常規(guī)飼養(yǎng)， 每天固定時(shí)間游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)， 體積計(jì)算公式： 體積 （mm3） ＝ 0.5× 長(zhǎng)度 × 寬2。 當(dāng)皮下腫瘤長(zhǎng)至約 1 000 mm3時(shí)， 造模完成。

1.2 設(shè)備自主搭建熒光腹腔鏡系統(tǒng) （圖1）， 該熒光內(nèi)鏡及光譜檢測(cè)分析系統(tǒng)主要包含： ①光源； ②光信號(hào)的采集器件及濾鏡； ③相機(jī) （CCD）； ④用于光譜采集與分析的光纖、 光譜儀；⑤計(jì)算、 輸入及輸出等的硬件系統(tǒng)； ⑥各模塊控制、 信息獲取及圖像呈現(xiàn)的軟件系統(tǒng)。

圖1 熒光腹腔鏡系統(tǒng)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法①設(shè)置熒光腹腔鏡參數(shù)： 參考ICG 溶液在該熒光腹腔鏡下的顯像效果， 設(shè)置785 nm 近紅外光源與普通白光，調(diào)試腹腔鏡工作距離與焦距， 并固定腹腔鏡與動(dòng)物操作臺(tái)之間的距離。 ②取模型小鼠 12 只， 隨機(jī)分為 3 組， 每組 4 只， 戊巴比妥鈉麻醉后， 分別尾靜脈注射 PBS 0.1 mL， 濃度 600 μg／mL的 ICG 溶液 0.1 mL 及相同當(dāng)量的 ICG 納米衍生物溶液 0.1 mL。注射后1、 2、 6 h 在熒光腹腔鏡下的動(dòng)物操作臺(tái)下觀察皮下瘤熒光顯像狀態(tài)， 拍照記錄。 ③電腦軟件及光譜儀分析： 取光譜儀在近紅外光源下對(duì)小鼠皮下瘤位置處進(jìn)行光譜分析并記錄。

2 結(jié)果

2.1 模型小鼠皮下瘤熒光腹腔鏡顯像比較不同組小鼠在分別注射PBS、 ICG 及ICG 納米衍生物后， 在皮下瘤處于與熒光腹腔鏡相同位置的情況下， 熒光顯像顯著不同， 其中ICG 組及ICG 納米衍生物組明顯可見(jiàn)皮下瘤處熒光顯像， PBS 組未見(jiàn)熒光顯像。 2 h 時(shí)， ICG 納米衍生物組較ICG 組熒光強(qiáng)度稍強(qiáng)。 6 h 時(shí)， ICG 組在皮下瘤處熒光基本消失， 而ICG 納米衍生物組仍具有一定熒光強(qiáng)度 （圖2a）。

2.2 模型小鼠皮下瘤光譜儀分析比較熒光腹腔鏡軟件分析，ICG 組和ICG 納米衍生物組小鼠腫瘤處平均熒光強(qiáng)度顯著高于PBS 組， 且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)ICG 納米衍生物組的平均熒光強(qiáng)度均較ICG 組強(qiáng)， ICG 組皮下瘤熒光在 6 h 后基本消失， 而 ICG 納米衍生物組仍存在 （圖 2b）。 經(jīng)光譜儀分析， ICG 組和 ICG 納米衍生物組小鼠在810 ～820 nm 可見(jiàn)典型透過(guò)率曲線 （圖2c）。

圖2 模型小鼠熒光腹腔鏡顯像情況

3 討論

ICG 是美國(guó)FDA 唯一允許的、 可安全應(yīng)用于臨床的熒光顯像劑， 具有低敏、 安全、 反應(yīng)快的特點(diǎn)［9］， 它的面世使得包括肝癌、 胃腸癌等的熒光腹腔鏡手術(shù)成為可能。 不同于其他顯像劑， 如納米碳、 美蘭等［10-11］， 低濃度 ICG 溶液在普通白光下呈淡綠色， 而術(shù)者可自由切換腹腔鏡的熒光模式和可見(jiàn)光模式， 在可見(jiàn)光模式下， 不會(huì)出現(xiàn)污染正常術(shù)野的情況， ICG 由肝代謝并經(jīng)膽道排出， 半衰期 3 ～4 min， 不會(huì)滯留體內(nèi)， 故ICG 不會(huì)出現(xiàn)腹腔內(nèi)溢出或者長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法代謝等問(wèn)題。

雖然ICG 的應(yīng)用前景巨大， 但I(xiàn)CG 亦存在高水解性、 快速血漿清除率和無(wú)相關(guān)特異性的缺點(diǎn)［12］， ICG 納米衍生物可較好地提高藥物的生物利用度， 改善穩(wěn)定性［13］。 生物納米材料能較好地包裹ICG， 避免ICG 快速地被血清蛋白結(jié)合而代謝。 再者， 納米材料在腫瘤中的應(yīng)用， 能提高ICG 的生物利用度， 并增強(qiáng)其滲透性和保留效應(yīng)， 即納米材料的被動(dòng)靶向作用， 納米材料能被動(dòng)地在腫瘤組織中富集， 從而提高了ICG 的生物利用度和一定的靶向性。

本研究通過(guò)構(gòu)建人Hct116 腫瘤細(xì)胞系裸鼠皮下瘤小鼠模型， 隨機(jī)分組后， 分別于小鼠尾靜脈注射相同體積的 PBS 溶液、 60 μg ICG 溶液和與 ICG 相同當(dāng)量的 ICG 納米衍生物， 并使用自主搭建的熒光腹腔鏡系統(tǒng)進(jìn)行圖像與光譜分析， 結(jié)果顯示， ICG 組與ICG 納米衍生物組小鼠皮下瘤熒光顯像明顯， 均可見(jiàn)ICG 特征的熒光光譜圖像， 而PBS 組無(wú)明顯熒光。 通過(guò)軟件分析腫瘤處平均熒光強(qiáng)度， 1 h 時(shí)， ICG 納米衍生物組較ICG組熒光稍強(qiáng)； 而 2 h 時(shí)， 兩組的差異較為顯著； 6 h 時(shí)， ICG 組熒光基本消失， 而ICG 納米衍生物組仍具有一定強(qiáng)度的熒光，光譜儀顯示模型小鼠皮下瘤處存在典型的ICG 激發(fā)光。 該結(jié)果表明使用熒光腹腔鏡在ICG 及ICG 納米衍生物等顯像劑的幫助下有利于辨別腫瘤與正常組織， 且ICG 納米衍生物可改善ICG熒光顯像的穩(wěn)定性與生物利用度。 ICG 的具體注射方法及其納米衍生物療效值得進(jìn)一步研究。