熱依麥阿依·阿布都艾尼， 陳 靜， 陳 蕓， 馬劉峰

(喀什大學生命與地理科學學院∥新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室， 喀什 844000)

土壤鹽漬化是一種全球范圍內的生態(tài)環(huán)境問題. 在全世界范圍內約有7%的土地和20%的耕地受到鹽漬化的威脅[1]. 鹽脅迫可以影響植物的種子萌發(fā)、生長、分化以及發(fā)育的各個階段[2]. 提高植物內在耐鹽基因的表達量，是鹽漬化土地資源開發(fā)利用的有效方式之一.

棉花是我國尤其是新疆重要的經濟作物之一，在我國棉花供應中發(fā)揮著重要的作用. 但在棉花生產過程中，經常遭受來自于土壤的鹽堿脅迫作用，土壤鹽漬化一直是制約新疆的棉花質量和產量的重要環(huán)境限制因子. 因此，通過挖掘和篩選棉花耐鹽相關基因，闡明它們在應答鹽脅迫中的分子調控機制，并利用相關耐鹽基因資源進行耐鹽棉花品種改良，為培育出對鹽脅迫耐受性更強的棉花新品種具有十分重要的意義.

目前，利用轉錄組技術進行鹽脅迫相關基因篩選和挖掘已經在多種植物中得到廣泛的應用[3]，LIU等[4]對大豆葉片和根在鹽脅迫下轉錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)使碳代謝和氮代謝相關基因的表達發(fā)生了顯著變化，表明碳代謝和氮代謝參與了大豆對鹽脅迫的應答過程. PRIYANKA等[5]對在150 mmol/L NaCl處理條件下的葡萄葉片進行轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)其碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝、脂類代謝途徑和次生代謝產物的合成等代謝通路參與葡萄應答鹽脅迫的過程. 陸地棉全基因組測序的完成也極大地推進了棉花功能基因的篩選[6]. 目前為止，有關棉花的抗逆基因研究取得了較大的進展，尤其是棉花耐鹽相關的分子生物學研究取得了很多成果，如LONG等[7]對亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉的NHX基因進行了全面、系統(tǒng)的比較研究，分別從這3種棉中鑒定了12、12和23個類NHX蛋白；基因結構分析表明，NHX基因內含子較多，可形成選擇性剪接，有利于植株適應土壤高鹽環(huán)境，其中GhNHX1定位于棉株的液泡系統(tǒng)，受鹽脅迫的強烈誘導. GhNHX1的沉默增強了棉花幼苗對高鹽濃度的敏感性. 在轉基因棉花中過表達K2-NhaD，能提高棉花植株的耐鹽、耐旱性，增加脅迫相關基因的表達，改善SOS途徑等代謝途徑[8]. 有關新疆主栽棉花品種的耐鹽基因篩選研究鮮有報道，本文以新疆主栽棉花品種為研究對象，以轉錄組學方法為基礎，篩選新疆棉花中的耐鹽相關基因，為更深入地了解棉花的耐鹽分子機制及選育棉花耐鹽新品種提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

以南疆地區(qū)主栽4個棉花品種(‘新陸中42號’、‘新陸中69號’、 ‘新陸中72號’及‘國審棉206-5’)為供試材料.

選取籽粒飽滿、大小一致的棉花種子，70%的酒精消毒1 min后，用30%的雙氧水浸泡1 h，再用無菌水沖洗3～5遍，無菌環(huán)境下放至種子萌發(fā)露白，在超凈工作臺上把露白的棉花種皮去掉，分別放入MS固體培養(yǎng)基和含0.50%NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，對照為不含NaCl的培養(yǎng)基. 每個培養(yǎng)基放3～4粒種子. 28 ℃培養(yǎng)，16 h光照/ 8 h黑暗，培養(yǎng)6 d.

1.2 棉花種子萌發(fā)期抗鹽性分析

將棉花種子分別在不同鹽質量分數(shù)(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50% NaCl)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，拍照并統(tǒng)計其萌發(fā)率.

1.3 總RNA提取

根據(jù)不同棉花品種的抗鹽性，對棉花培養(yǎng)6 d的‘新陸中69號’棉花根系，用天根公司植物多酚多糖RNA提取試劑盒提取總RNA，電泳檢測合格后，由上海派森諾公司進行轉錄組測序分析.

1.4 測序文庫構建及轉錄組測序數(shù)據(jù)分析

選擇4個樣本進行實驗，包含2個重復對照(CK1、CK2)和2個處理(NaCl1、NaCl2)，將待測序列樣品用Illumina Hiseq測序平臺上機測序之前把每個樣本的mRNA打斷成300 bp左右大小的片段，然后反轉錄成cDNA，最后每個片段加上一個標簽序列，就構建成樣本文庫，文庫名按照CK1、CK2、NaCl1和NaCl2的順序分別命名為LRA01810、LRA01811、LRA01812和LRA01813. 待序列下機之后就可以按照文庫的標簽序列區(qū)分不同的樣本列.

對下機數(shù)據(jù)進行CASAVA堿基識別分析，獲得測序數(shù)據(jù)序列信息，利用fastQC軟件對原始數(shù)據(jù)進行質量分析[9]，而后利用 NGSQC Toolkit去除低質量堿基后得到Clean Reads[10]. 使用Hisat2軟件將Clean Reads比對到陸地棉基因組上，而后再使用Stringtie軟件對轉錄本進行組裝[11]. 使用Htseq軟件對得到的轉錄本進行表達定量分析. Q20和Q30分別代表被99%和99.9%測準確的堿基數(shù).N代表測序儀不能確切地測定出某一個堿基時的百分比(%)，測定不出的堿基就會標注為N.

1.5 差異表達基因篩選及功能富集分析

采用R語言DESeq程序包對表達基因進行差異分析，篩選差異表達基因條件為：表達差異倍數(shù)|log 2(Fold Change)|>1 ，顯著性P<0.05[9]. 對得到的差異基因進行GO注釋和KEGG通路分析.

1.6 基因表達檢測

利用上述方法提取‘新陸中69號’棉花根系RNA，5X All-In- One RT MasterMix反轉錄試劑盒(購買自Applied Biological Materials (abm) Inc.)進行cDNA合成. 根據(jù)已知的基因序列，設計RealTime PCR引物(表1)，按照TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex TaqTMII說明書進行Real Time PCR. PCR反應條件為：95 °C 30 s，1個循環(huán)；95 °C 5 s，60 °C 34 s，共39個循環(huán). 利用2-ΔΔCT方法分析基因的相對表達量.

表1 檢測基因表達的引物序列Table 1 The primer of gene expression detected

2 結果與分析

2.1 棉花品種間的耐鹽性比較及耐鹽品種篩選

通過對4種棉花種子在不同鹽質量分數(shù)條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)‘新陸中69號’棉花種子萌發(fā)最多(圖1A). 隨著處理的鹽質量分數(shù)增加，4種棉花種子的萌發(fā)率都下降，其中‘新陸中69號’棉花種子的萌發(fā)率最高(圖1B)，表明其具有較強的耐鹽性.

圖1 棉花品種間耐鹽性比較Figure 1 The comparison of salt tolerance among cotton varieties

2.2 鹽脅迫處理的棉花根系測序質量分析

選擇經0.50% NaCl處理的新陸中69號品種根系提取RNA，進行轉錄組分析. Illumina Hiseq平臺測序結果表明：CK1、CK2、NaCl1、NaCl2獲得的原始Reads分別是49 841 082、41 348 682、42 165 466、45 793 106條，去除接頭序列和低質量堿基后，獲得的Reads分別是49 665 682、41 187 572、41 939 240和45 577 200條，且Q20和Q30分別達到97%和94%以上，說明轉錄組測序質量較高(表2).

表2 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計Table 2 The data filtering statistics

2.3 鹽脅迫下棉花根系差異表達基因分析

與對照材料相比(圖2)，經過0.50% NaCl處理6 d后的棉花植株中有1 557個基因表達量發(fā)生顯著變化. 其中，在鹽脅迫條件下，有891個基因表達量增加，而666個基因表達量出現(xiàn)下調.

圖2 棉花根系差異表達基因的火山圖Figure 2 The volcano plot of differentially expressed genes in cotton roots

2.4 差異表達基因GO和KEGG注釋分析

對得到的棉花根系差異表達基因進行GO注釋分析(圖3A)，結果表明：在細胞組分分類中，差異基因共注釋到65個條目，其中注釋到最多的是細胞膜組分，共有173個基因；在分子功能分類中，差異基因共注釋到261個條目，其中共有162個基因功能注釋為氧化還原酶類，這說明氧化還原酶類基因在對于棉花應答鹽脅迫是十分重要的；在生物學過程分類中，注釋到最多的是代謝進程，共有440個基因，當植物受到鹽脅迫后，會通過改變相應的代謝進程對鹽脅迫做出應答，從而提高自身對鹽脅迫的抵御能力. 因此，參與植物各種代謝進程的基因在植物應答鹽脅迫過程中有著重要的意義.

KEGG分析的結果顯示：差異基因富集到20條代謝通路上，主要集中在木質素生物合成途徑，該途徑在植物體的機械支持、水分運輸以及抵抗各種不良環(huán)境影響中起著很重要的作用；其中，有64個差異基因富集到苯丙烷合成代謝途徑，是富集差異基因最多的代謝途徑. 此外，半乳糖代謝、胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、鞘脂代謝、類黃酮生物合成、MAPK信號通路等代謝途徑也富集到較多的差異基因(圖3B)，說明這些代謝途徑可能在棉花應答鹽脅迫過程中具有重要的作用.

圖3 棉花根系差異表達基因的GO和KEGG注釋分析Figure 3 The GO and KEGG pathway annotation analysis of differentially expressed genes in cotton roots

2.5 棉花響應鹽脅迫期間差異基因表達變化

利用差異倍數(shù)大于2、校正后的P小于0.01進行差異基因的篩選，選取對照和鹽脅迫條件下基因表達差異性最大的10個差異基因(表3)，分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對和基因功能注釋分析，結果表明：編號為Cot-AD 05721、Cot-AD 54195 和Cot-AD 47521的基因參與了ABA信號通路，其中，編號為Cot-AD 05721的基因屬于富含半胱氨酸類受體激酶(CRK)基因家族，該基因家族編碼的蛋白是植物體內普遍存在的一類蛋白激酶，是許多信號識別傳遞途徑中的關鍵組分，作為識別信號的質膜受體，能夠感受外界刺激，通過磷酸化作用參與胞內信號傳遞[12]；Cot-AD 54195基因編碼的蛋白主要參與調控環(huán)核苷酸離子通道(CNG)，在Ca2+響應以及抗鹽脅迫信號傳導中發(fā)揮重要作用[13]；Cot-AD 47521基因編碼的蛋白是受體蛋白激酶家族中LRR型類受體蛋白激酶，能夠參與植物脅迫應答過程[14]. Cot-AD 49287編碼角鯊烯環(huán)氧酶(SQE)，可催化鯊烯轉變?yōu)榄h(huán)氧化鯊烯. 擬南芥SQE1可參與調節(jié)根和種子萌發(fā)[15]. Cot-AD 56209可編碼硫氧還蛋白. Cot-AD 17346編碼的蛋白具有丙氨酰-tRNA合成酶活性. Cot-AD 50458編碼SPX1-like蛋白，AtSPX1在擬南芥葉片衰老中發(fā)揮重要作用[16]. Cot-AD 34390編碼的是ABCG家族基因，可參與對ABA轉運. Cot-AD 55296編碼AMSH-like泛素硫酯酶，擬南芥AMSH3參與泛素化膜蛋白的降解過程[17]. Cot-AD 59144編碼的是細胞色素P450家族基因，是一種末端加氧酶，可參與生物體內甾醇類激素合成等過程.

表3 鹽脅迫下篩選的10個差異基因Table 3 The 10 DEGs screened under salt stress

利用qRT-PCR檢測棉花鹽脅迫處理后上述基因的表達變化，結果表明：編號為Cot-AD 05721和Cot-AD 49287的基因上調表達；編號為Cot-AD 54195、Cot-AD 56209、Cot-AD 17346、Cot-AD 34390、 Cot-AD 50458、Cot-AD 55296、Cot-AD 59144和Cot-AD 47521的基因下調表達. 10個基因的表達量變化趨勢均與轉錄組結果一致，統(tǒng)計相關性系數(shù)R2為0.923 4，具有良好的線性關系，說明轉錄組測序的質量較高(圖4).

圖4 qRT-PCR檢測在棉花鹽脅迫時差異基因的表達Figure 4 The expression analysis of different genes detected by qRT-PCR

3 討論

當植物受到鹽脅迫后，植物會通過調控耐鹽相關基因表達來應對鹽脅迫的威脅. 植物的根部是決定整個植株生長發(fā)育的關鍵器官，由于根部直接接觸土壤中的鹽離子，也是接受鹽脅迫信號的最初位點，因此對鹽脅迫的反應也最為敏感、準確[2，18]. 基于此，本文選擇棉花根部作為實驗取材部位，旨在通過轉錄組學方法從棉花根系中篩選出棉花耐鹽相關基因. 所備選的4個新疆主栽棉花品種中，‘新陸中69號’品種表現(xiàn)出較好的耐鹽性，適合作為轉錄組篩選耐鹽基因的實驗材料. 通過將對照組和鹽脅迫處理組的棉花根系轉錄組測序結果進行分析，結果從‘新陸中69號’中篩選到1 557個差異表達基因，其中有891個基因表達量上調，666個基因表達量下調. 有64個差異基因富集到苯丙烷類合成代謝途徑中，是富集差異基因最多的代謝途徑，這說明在棉花抵御鹽脅迫過程中，苯丙烷類合成代謝途徑發(fā)揮了重要的調控功能. 其他差異表達基因多集中在半乳糖代謝、胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝等途徑.

通過qRT-PCR方法對棉花響應鹽脅迫時差異性較大的10個基因表達分析的變化結果與轉錄組分析結果一致. 其中，編號為Cot-AD 05721的基因屬于CRK家族基因，可參與細胞生物和非生物應激反應. 擬南芥CRK2基因能提高種子萌發(fā)期幼苗的耐鹽性，并調節(jié)幼苗的根長.CRK2是鹽誘導胼胝質沉積所必需的關鍵基因，通過胼胝質沉積對鹽分增加的響應作用，證明CRK2基因在種子萌發(fā)過程中耐鹽性的重要性[19]. 本文中轉錄組結果顯示：棉花在鹽脅迫后編號為Cot-AD 05721的基因表達量上調，推測該基因在棉花耐鹽脅迫應答分子調控過程中發(fā)揮一定的作用. 編號為Cot-AD 54195的基因屬于調控環(huán)核苷酸離子通道CNG家族基因，CNG家族在抗鹽脅迫信號傳導中發(fā)揮重要作用. 編號為Cot-AD 47521的基因屬于LRR型受體蛋白激酶家族成員，JUNGA等[20]發(fā)現(xiàn)辣椒中LRR受體蛋白激酶基因CaLRR1的表達受高鹽的脅迫誘導，說明LRR可作為信號識別受體在多種信號途徑中起作用.

擬南芥植物中角鯊烯環(huán)氧化酶(SQE)可以環(huán)氧化角鯊烯為氧化三萜類化合物，在植物根和下胚軸伸長過程中發(fā)揮重要作用[15]. 本研究表明：編號為Cot-AD 49287的基因是一類編碼SQE的基因，該基因表達量顯著上調，表明其功能可能與棉花種子萌發(fā)期的根系伸長調控過程有密切關系. 編號為Cot-AD 56209的基因屬可編碼硫氧還蛋白，調控細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，而Cot-AD 17346編碼的蛋白則具有丙氨酰-tRNA合成酶活性. 目前，有關這2個基因在棉花根系發(fā)育和鹽脅迫中的調控過程如何發(fā)揮作用，未見相關文獻報道，作用機理尚不明確.

鹽漬環(huán)境下，植物根系的鹽分與營養(yǎng)元素之間產生協(xié)同或拮抗作用. 在鹽堿條件下，植物根系會降低對必需的大量營養(yǎng)元素磷的吸收能力，使磷的吸收和運輸以及在體內的分配遭到破壞, 導致營養(yǎng)失衡并加速植物葉片的衰老過程[21]. 擬南芥衰老葉片中存在顯著的磷酸鹽饑餓誘導基因AtSPX1. AtSPX1是擬南芥葉片衰老、Pi饑餓和SA信號通路之間的關鍵調控因子[16]. 本文研究表明：Cot-AD 50458是一類編碼SPX1-like蛋白的因子，該基因表達量在鹽脅迫環(huán)境下表達量顯著下調，推測可能是在鹽脅迫的作用下抑制了棉花對磷元素的吸收功能，增加棉花葉片的衰老過程.ABCG家族基因，可參與植物對ABA的轉運，其中ABCG25和ABCG40是高親和脫落酸(ABA)轉運蛋白. ABCG14與細胞分裂素生物合成高度共表達，是根至芽的主要細胞分裂素轉運體. 編號為Cot-AD 34390的基因屬于ABCG家族基因，推測Cot-AD 34390可能參與了棉花在鹽脅迫時期的ABA轉運功能. Cot-AD 55296是一類可編碼AMSH-like泛素硫酯酶，KATSIARIMPA等[17]研究表明：擬南芥AMSH3基因調控泛素化膜蛋白的降解過程，泛素翻譯后修飾在調節(jié)內吞降解過程中起關鍵作用；擬南芥AMSH3是一種去泛素酶，amsh3缺失突變體導致幼苗的致死率大幅提高，并在多種細胞內轉運途徑中都表現(xiàn)出缺陷.

編號為Cot-AD 59144的基因是細胞色素P450家族基因，是一種末端加氧酶，可參與生物體內甾醇類激素合成等過程. MAGWANGA等[22]研究表明：棉花CYP450基因在響應植株干旱和鹽脅迫等逆境環(huán)境刺激過程中，發(fā)揮著重要的調控作用. 同樣，在擬南和水稻中，細胞色素P450蛋白家族可通過赤霉素失活在植物發(fā)育過程中發(fā)揮著靶特異性調控作用[23].PtCYP714A3在形成層-韌皮部組織中廣泛表達，且在楊樹中受鹽脅迫和滲透脅迫影響較大.PtCYP714A3異位表達導致水稻半矮化表型，分蘗促進，籽粒變小[24]. 過量表達PtCYP714A3基因的轉基因株系較野生型植株，GA積累水平更低，部分GA生物合成基因的表達受到明顯抑制，表明PtCYP714A3在水稻幼苗對鹽毒反應中起著重要的作用[23].

本研究對鹽脅迫下棉花根系進行轉錄組分析，通過與正常培養(yǎng)條件下比較，初步篩選出的差異表達基因，通過qRT-PCR方法，對部分差異顯著的基因表達進一步驗證. 后續(xù)實驗會克隆這些經過驗證的完整cDNA序列，通過構建過量表達載體，將基因轉化到擬南芥和棉花植株中進行基因功能的遺傳學分析，其結果為進一步克隆棉花關鍵抗鹽基因和認識其功能提供了依據(jù)，也為揭示棉花的抗鹽機制奠定了基礎.

致謝 感謝華南師范大學生命科學學院李玲教授對本論文的指導.