鄭澤群 廉姜芳

1 概述

長QT綜合征(LQTS)主要分為17個亞型，是由15個常染色體上顯性遺傳相關基因突變導致的，2型長QT綜合征(LQT2)是國內(nèi)最常見的臨床亞型，占全部病例的30%～45%[1]，由定位于7q35～36上的KCNH2基因(又稱hERG)發(fā)生突變所致。hERG編碼心肌細胞膜上快速延遲整流鉀電流(IKr)通道的α亞基，IKr是心肌復極化的主要離子流，突變的hERG基因使hERG通道蛋白功能表現(xiàn)為單倍型不足或顯性負效應，導致IKr電流減少或完全消失，心電圖表現(xiàn)為QT間期延長和T波異常[2-3]。在休息或睡眠狀態(tài)下，突然的噪音、驚嚇等相關刺激導致患者體內(nèi)交感系統(tǒng)激活，引發(fā)異常鈣瞬變，是LQT2發(fā)生致命性心律失常如尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(TdP)的誘發(fā)因素，可突發(fā)暈厥甚至心源性猝死。

應用β受體拮抗劑及植入心律轉(zhuǎn)復除顫器(ICD)等治療對預防高風險患者發(fā)生致命性心律失常有一定作用[4]。然而，接受治療的患者(尤其是女性)仍存在較高生命風險及嚴重并發(fā)癥風險[5]。由于病理機制復雜及臨床表現(xiàn)多樣，LQT2的治療仍面臨嚴峻挑戰(zhàn)。近年來，基因編輯及干細胞技術的發(fā)展促進了LQT2相關研究，特別是人誘導多功能干細胞(hiPSC)，為測試新治療方法及疾病建模提供了良好的工具[6]。目前，針對hERG突變相關機制，利用hiPSC等技術的獨特優(yōu)勢，不僅能夠在體外近似地表達疾病的相關表型[7-8]，還可以將糾正LQT2表型的新藥轉(zhuǎn)化到臨床，并顯示了良好的臨床適應性[4]。

2 hERG通道

IKr通道由主要的α亞基和輔助性β亞基構(gòu)成，α亞基由hERG編碼，是發(fā)揮通道作用的主要功能單位，hERG蛋白含1 159個氨基酸，由6個跨膜片段以及N端Per-Arnt-Sim(PAS)域和C端環(huán)狀核苷酸結(jié)合域(cNBD)組成，4個hERG編碼的亞基組成四聚體與輔助亞基共同發(fā)揮作用[2,9]。hERG基因經(jīng)核轉(zhuǎn)錄、核糖體翻譯后，需經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)加工進行核心糖基化、折疊及組裝，正確折疊的蛋白質(zhì)將進入高爾基體進一步復合糖基化，合格的蛋白質(zhì)會被運輸?shù)桨ぐl(fā)揮作用，不合格的蛋白質(zhì)將會被送回ER。如果正確折疊仍無法完成，則將滯留在ER中，進而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)，導致蛋白進入泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)進行降解[10-12](見圖1)。上述hERG蛋白合成及轉(zhuǎn)運過程的各個步驟都需要熱休克蛋白(HSP)70/90、鈣聯(lián)蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、GTP結(jié)合蛋白Rab11B、高爾基體基質(zhì)蛋白GM130等分子伴侶參與[13]，眾多因素如溫度、低氧、pH值、鉀濃度都可以影響hERG蛋白成熟[2]。研究顯示體內(nèi)雌激素水平與QT間期有關，雌二醇能夠通過增強的雌二醇α受體介導的HSP90相互作用增加hERG通道膜轉(zhuǎn)運及復極化電流[14]。人類J蛋白DNAJB12和DNAJB14通過獨立于HSP70的機制促進了Ego相關基因(ERG)K+通道亞基的四聚體組裝，過表達DNAJB14可以通過穩(wěn)定突變的蛋白質(zhì)改變hERG通道功能缺陷，這證實伴侶蛋白對于亞基穩(wěn)定性和K+通道的膜定位是必需的[15]。

圖 1 hERG蛋白的表達調(diào)控

IKr電流的減少程度與hERG基因突變部位相關。據(jù)報道，52%的hERG基因突變發(fā)生在蛋白胞內(nèi)區(qū)域，30%發(fā)生在跨膜區(qū)域，12%發(fā)生在孔區(qū)，6%發(fā)生在胞外。其中突變發(fā)生在跨膜區(qū)及孔區(qū)(離子進出)導致的IKr電流減少最嚴重[1]，該區(qū)域也是眾多引發(fā)獲得性長QT的藥物的作用位點[16-17]。功能研究表明，約90%的錯義突變通過影響蛋白轉(zhuǎn)運抑制通道功能，這種突變稱為Ⅱ類突變；Ⅰ類突變影響蛋白的合成與翻譯，而Ⅲ類和Ⅳ類突變則分別通過干擾hERG通道門控特性及減少K+跨膜轉(zhuǎn)運抑制IKr電流[13,18]。

針對不同類型的突變，增加IKr通道電流的干預策略包括通道激活劑、競爭性通道結(jié)合、促進hERG蛋白轉(zhuǎn)運、膜定位以及基因編輯等。hERG蛋白轉(zhuǎn)運缺陷是最主要的發(fā)病機制[19]，對這種突變機制的相關研究已經(jīng)取得一定成果。

3 LQT2的治療

LQT2一般采用β受體阻滯劑、交感神經(jīng)切除等，必要時行ICD植入等治療，對于預防惡性心律失常發(fā)生起到一定作用。目前，在比較成功地揭示了相關致病基因?qū)е虏煌潭菼Kr減少的前提下，結(jié)合基因編輯及hiPSC技術，為靶向精準治療提供了實踐可能[20]。

3.1 hERG通道變構(gòu)調(diào)節(jié)及再轉(zhuǎn)運

hERG通道的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑能夠與其不同位點結(jié)合而改變IKr通道活性，從而起到改變其功能表達的作用。LUF7346作為一種新型hERG變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，被Sala等[21]證實在不同的實驗模型中能夠逆轉(zhuǎn)先天性和獲得性LQTS的表型，在阿司咪唑引起的疾病模型中，應用LUF7346解除了藥物的鉀通道位阻效應，表明在hERG基因的Ⅲ、Ⅳ類突變時進行hERG通道的變構(gòu)調(diào)節(jié)似乎是有益的，這也為LQT2的治療帶來新的思路。

對于廣譜蛋白酶體抑制劑ALLN，既往的HEK細胞模型表明該藥物能夠改變突變的hERG的蛋白表達。Mehta等[22]應用ALLN處理攜帶hERG A561V錯義突變的hiPSC分化的心肌細胞，免疫熒光顯示hERG蛋白膜定位增加，膜片鉗顯示IKr增強，證實了ALLN能夠使hERG蛋白再轉(zhuǎn)運，進而糾正LQT2表型。

囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子(CFTR)基因突變是造成囊性纖維化的原因，藥物魯瑪卡托(VX-809)作為蛋白質(zhì)折疊分子伴侶，能夠促進突變型CFTR(F508del-CFTR)蛋白成熟，起到治療作用[23-24]。研究顯示，糾正F508del-CFTR蛋白轉(zhuǎn)運的小分子藥物能夠通過不同機制對其他突變蛋白轉(zhuǎn)運缺陷起作用[25]?；诖饲疤?，為了驗證魯瑪卡托是否能夠糾正hERG蛋白轉(zhuǎn)運，Mehta等[18]成功應用干細胞分化的心肌細胞模型證實魯馬卡托能夠糾正LQT2的Ⅱ類突變和表型，促進hERG成熟，使IKr增加，且顯示出較強的異常鈣瞬變處理能力，在預防心律失常方面比β受體阻滯劑更有效。Schwartz等[4]又進一步應用魯馬卡托+依伐卡托治療了2例LQT2患者(第1天半量，第2天起全量魯馬卡托800 mg+依法卡托500 mg至第8天)，治療后心電圖顯示QT間期縮短，且治療過程中患者僅有腹瀉的不良反應。

3.2 規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(CRISPR)/規(guī)律間隔成簇短回文重復序列關聯(lián)蛋白9(Cas9)、RNA干擾(RNAi)

CRISPR/Cas9技術能夠?qū)Σ煌矬w進行基因組編輯，通過選擇性敲除及導入基因，在基因復制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面起重要作用[26]。Mesquita等[27]將攜帶R534C突變的LQT2患者的血單核細胞重編程為hiPSC，并使用CRISPR/Cas9將相同的突變基因插入到對照hiPSC系中，結(jié)果表明該技術可以糾正或引入相關基因使hiPSC分化的心肌細胞表型發(fā)生改變，進而控制患者的遺傳背景和表觀遺傳變異性。Chai等[28]應用干細胞建立的模型驗證了hERG基因同種類型的突變可以導致不同的臨床表型，他們還用基因測序鑒別出了新的突變體KCNK17及REM2，并使用CRISPR/Cas9技術將REM2 G96A突變體等位基因校正為野生型，結(jié)果動作電位時程和L型鈣離子電流(ICaL)恢復并接近正常水平。Garg等[29]利用CRISPR/Cas9編輯疾病特異性hiPSC分化的心肌細胞基因，通過糾正異常突變體及導入相關突變基因到正常細胞系中，實現(xiàn)了突變基因的敲除與導入，并表現(xiàn)為LQT2。這種通過基因編輯改變基因型導致不同的效應，對于先天性LQT2治療具有重要意義，但基因編輯改造了基因型，基因編輯是否會引起其他基因的異常突變等問題仍需進一步考慮。

結(jié)合hiPSC，RNAi也被應用在LQT2的研究中，RNAi能夠使同源mRNA高效特異性降解，沉默相關基因表達。Matsa等[30]用突變特異性小干擾RNA(siRNA)處理LQT2患者來源的hiPSC分化的心肌細胞，電生理分析顯示IKr電流有所恢復，證實RNAi在體外模型中可以發(fā)揮基因調(diào)控作用，進而糾正LQT2表型。

包括LQT2在內(nèi)的多種離子通道病仍有待進一步研究，應用新的研究技術有望推進LQT2的治療。然而，在精準醫(yī)療的背景下，研究成果的臨床轉(zhuǎn)化也只有在更加成熟地應用上述技術后，才能使疾病處在更加可防、可控的狀態(tài)下。