王珊珊 王天明 劉興元

先天性心臟病是人類最常見的發(fā)育畸形，其中又以心房間隔缺損(ASD)、心室間隔缺損的發(fā)生率最高[1]。嚴重的心臟間隔缺損可導(dǎo)致腦損傷或中樞神經(jīng)發(fā)育延遲、肺動脈高壓、血栓栓塞、感染性肺炎或心內(nèi)膜炎、充血性心力衰竭、心律失常，甚至心源性猝死[1-3]。越來越多的研究表明遺傳缺陷是先天性心臟缺損的主要病因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60多個致病基因，其中大部分編碼的是心臟核心轉(zhuǎn)錄因子[4-5]。作為一個重要轉(zhuǎn)錄因子，國外的研究發(fā)現(xiàn)TBX5基因突變可導(dǎo)致多種類型的先天性心臟病，但以ASD最為多見[6-7]。因此，有必要研究TBX5基因在中國漢族ASD患者中的突變率并揭示其致病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在2017年3月至2019年7月間從中國漢族人群收集了62例無血緣關(guān)系的新生兒ASD患兒和108名無血緣關(guān)系且年齡、性別相匹配的健康對照者。全部入選研究對象均詳細了解病史及家族史，進行全面體格檢查、超聲心動圖檢查和常規(guī)化驗檢查。所有ASD患者均有超聲心動圖檢查證據(jù)，所有健康對照者的超聲心動圖檢查結(jié)果正常且無先天性心臟病家族史。在62例ASD患兒中，男37例，女25例，年齡為0～28 d，平均年齡10 d，有陽性家族史者4例；在108名健康對照者中，男65名，女43名，年齡為0～28 d，平均年齡10 d。本研究遵循醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范，經(jīng)法定監(jiān)護人知情同意后收集其外周靜脈全血約0.2 mL，使用血液基因組DNA純化試劑盒(德國Qiagen公司)提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 TBX5基因體外擴增 通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體外特異性擴增TBX5基因整個編碼區(qū)，剪接位點所用的引物見參考文獻[8]。應(yīng)用熱啟動高保真 DNA聚合酶(德國Qiagen公司)和TBX5基因擴增引物等試劑，以基因組DNA為模板，在C100 Touch型PCR儀(美國Bio-Rad公司)上擴增TBX5基因片段。每一個PCR的總體積是50 μL，包括雙蒸水26 μL、5×PCR緩沖液10 μL(含有dNTP)、5×Q液10 μL、正向引物(20 μmol/L)1 μL 、逆向引物(20 μmol/L)1 μL、基因組DNA(100 ng/μL)1μL、Taq DNA 聚合酶(2.5 units/μL) 1 μL。PCR條件：首先95 ℃ 熱激活5 min，隨后35個循環(huán)，每一循環(huán)95 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延長1 min，最后72 ℃延長8 min。所擴增的產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用凝膠回收試劑盒(德國Qiagen公司)純化。

1.2.2 TBX5基因測序分析 使用正向或反向TBX5基因擴增引物，以純化的基因片段為模板，應(yīng)用DNA循環(huán)測序試劑盒(美國Applied Biosystems公司)在ProFlex型PCR儀(美國Thermo Fisher公司)上進行測序PCR反應(yīng)。每一測序PCR的總體積為20 μL，其中包括雙蒸水9 μL、純化的DNA片段(50 ng/μL)2 μL、上游或下游引物(2 μmol/L) 1 μL、預(yù)混合液8 μL。測序PCR的條件見參考文獻[9]。測序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后在3730型DNA測序儀(美國Applied Biosystems公司)上進行測序。將所測的NTBX5序列與Nucleotide數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide)中的TBX5序列(登陸號：NM_000192.3)進行對比分析以識別TBX5基因突變。如果發(fā)現(xiàn)TBX5基因突變，檢索SNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)、genomAD (http://gnomad.broadinstitute.org)、PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)和萬方(http://librarian.wanfangdata.com.cn)數(shù)據(jù)庫，以明確所發(fā)現(xiàn)的基因突變是否有報道。

1.2.3 真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及定位誘變 野生型TBX5-pcDNA3.1真核表達質(zhì)粒構(gòu)建如前所述[8]。以野生型TBX5-pcDNA3.1為模板，使用一對以突變點為中心、長31個堿基的互補引物和QuikChange定位誘變試劑盒(美國Strategene公司)通過PCR引入所發(fā)現(xiàn)的點突變，經(jīng)DpnI酶切、凝膠電泳分離后純化可得突變型TBX5-pcDNA3.1質(zhì)粒，然后經(jīng)測序證實。表達螢火蟲熒光素酶的報告質(zhì)粒心房利鈉因子-熒光素酶(ANF-luc)及表達海腎熒光素酶的內(nèi)對照質(zhì)粒pGL4.75如前所述[8]。

1.2.4 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及報告基因分析 COS-7細胞的培養(yǎng)、借助脂質(zhì)體進行的細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染如前所述[8]。轉(zhuǎn)染后48 h 收集、裂解細胞，應(yīng)用雙熒光素酶報告基因分析試劑盒(美國Promega公司)依次檢測螢火蟲、海腎熒光素酶的活性，并以二者的比值表示ANF基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗均1式3份平行進行，以3次實驗結(jié)果的平均值作為最終的結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

連續(xù)變量以均數(shù)±標準差表示。兩組組間連續(xù)變量的比較使用非配對Student′st檢驗；分類變量的比較使用Fisher′s精確概率檢驗或Pearson′s卡方檢驗。以雙側(cè)檢驗值P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)TBX5基因新突變

通過對62例無血緣關(guān)系的ASD患兒的TBX5基因進行測序分析，結(jié)果在1例家族史陰性的ASD患兒中發(fā)現(xiàn)了1個雜合性突變，其TBX5基因編碼核苷酸序列第318位的胞嘧啶(C)變成了鳥嘌呤(G)，即c.318C>G突變，相應(yīng)地氨基酸編碼序列第106位的酪氨酸密碼子變成了終止密碼子，即p.Y106X突變，突變率約為1.6%。該無義突變不存在于108名健康對照新生兒，在SNP、genomAD、PubMed和萬方數(shù)據(jù)庫中也未見報道。該攜帶TBX5基因突變的ASD患兒的超聲心動圖見圖1。TBX5基因c.318C>G雜合突變及其純合野生型對照堿基序列見圖2。

2.2 突變型TBX5的轉(zhuǎn)錄活性喪失

如圖3所示，等量(0.6 μg)的野生型和Y106X突變型TBX5對靶基因心房利鈉肽(ANP)啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用分別約為12倍和1倍(純合突變型TBX5與純合野生型TBX5比較：t=13.89，P<0.01)；而等量(各0.3 μg)的野生型和Y106X突變型TBX5共轉(zhuǎn)染時，對ANP啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用約為5倍(雜合突變型TBX5與純合野生型TBX5比較：t=7.4，P<0.01)。

圖 1 攜帶TBX5基因突變的ASD患兒的超聲心動圖

注：箭頭分別指向TBX5基因c.318C>G雜合突變型C/G和純合野生型C/C序列

注：與純合野生型TBX5相比，P均<0.01

3 討論

本研究在1例先天性ASD新生患兒中檢測出了1個新的TBX5基因雜合突變c.318C>G(p.Y106X)，該無義突變不存在于108名健康對照者。生化分析表明該突變導(dǎo)致TBX5對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活功能障礙。因此，TBX5基因c.318C>G(p.Y106X)突變很可能是導(dǎo)致該新生兒患者ASD的分子病因。

人類TBX5基因位于染色體12q24.1，編碼蛋白質(zhì)由518個氨基酸組成。TBX5蛋白含有一個功能上非常重要的結(jié)構(gòu)域，被稱為T盒(氨基酸53-241)，主要作用是與特定的靶基因啟動子DNA結(jié)合以激活或增加其表達以及與其他轉(zhuǎn)錄合作伙伴相互作用協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的表達[6-8]。先前的實驗研究表明，TBX5可單獨激活或與轉(zhuǎn)錄合作伙伴GATA4、GATA6、NKX2-5和TBX20等協(xié)同激活在心臟發(fā)育過程中表達的多個重要靶基因，包括ANP、肌球蛋白重鏈6(MYH6)、血清反應(yīng)因子(SRF)和縫隙連接蛋白 40(CX40)等，而且GATA4、GATA6、NKX2-5和TBX20等功能缺失性突變均可導(dǎo)致ASD[5-7]。在本研究中，在ASD患者發(fā)現(xiàn)的TBX5突變位于T盒，導(dǎo)致TBX5蛋白截短，失去了大部分T盒結(jié)構(gòu)，預(yù)測可導(dǎo)致TBX5的轉(zhuǎn)錄功能障礙。報告基因分析表明，突變型TBX5對靶基因ANF的轉(zhuǎn)錄激活作用消失。這些研究結(jié)果表明，基因突變所致的 TBX5單倍性不足可能是ASD的分子機制之一。

TBX5基因功能異常導(dǎo)致胚胎心臟發(fā)育畸形如ASD等已在動物模型得到證實。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，TBX5大量表達于心臟新月體和線性心臟管、左心室、室間隔、小梁、心房以及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)[10-11]。TBX5基因敲除純合子小鼠胚胎期死亡，主要原因在于心臟環(huán)化障礙以及左心室和竇房結(jié)發(fā)育不全；而TBX5基因敲除雜合子小鼠則可表現(xiàn)為ASD、室間隔缺損、心內(nèi)膜墊缺損、左心室發(fā)育不良以及傳導(dǎo)系統(tǒng)功能異常，包括房室和束支傳導(dǎo)阻滯等[10-12]。這些動物實驗研究表明TBX5在胚胎心臟正常發(fā)育方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

人類TBX5大量表達于胚胎及出生后心臟[13]，TBX5基因突變可導(dǎo)致Holt-Oram 綜合征即手心綜合征，表現(xiàn)為手、前肢及心臟畸形以及傳導(dǎo)阻滯，而且心臟畸形可單獨出現(xiàn)，其中以ASD最為常見[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TBX5基因功能喪失性突變還可導(dǎo)致擴張型心肌病[8,14]、心房顫動[15]、急性心肌梗死[16]。本研究在ASD患兒發(fā)現(xiàn)TBX5基因功能喪失性突變，提示其將來可能易于發(fā)生擴張型心肌病、心房顫動或急性心肌梗死。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)TBX5基因新突變可導(dǎo)致ASD，并初步揭示了其致病機制，對ASD的個體化防治具有一定的臨床意義。