袁曉晴 彭凌 陳錦紅 溫權(quán) 劉博婷 蔡鞏林

摘要：對豬丹毒絲菌SpaA蛋白進行生物信息學(xué)分析，并對比了豬丹毒絲菌弱毒菌株和野生強毒菌株間的差異。結(jié)果顯示，由于豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白缺少一段含有80個氨基酸的序列，使得該菌株的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、二級和三級結(jié)構(gòu)與強毒株的SpaA蛋白質(zhì)相比均有所差異，導(dǎo)致這2株菌株引發(fā)機體產(chǎn)生的免疫原性和抗原性強弱有所不同，推測這2株菌株中，SG7菌株的免疫原性相對GC42較強;GC42菌株的抗原性相對SG7菌株的抗原性來說較弱，而豬丹毒絲菌GC42菌株的毒力相對豬丹毒絲菌SG7菌株較弱，因此呈現(xiàn)弱毒菌株特性;推測2株菌株的氨基酸序列均在193～206、217～231、290～309、313～327、328～376、386～457區(qū)段具有較高的形成B細胞表位的可能性。

關(guān)鍵詞：豬丹毒絲菌;SpaA蛋白;弱毒菌株;生物信息學(xué)分析;B細胞抗原表位

中圖分類號： S852.61 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0070-06

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）是一種人畜共患傳染病的病原菌，人感染后表現(xiàn)為類丹毒癥狀，豬感染后表現(xiàn)急性或亞急性敗血癥，這種病原菌廣泛分布在各個國家，我國也是豬丹毒流行較廣泛的國家之一[1]。豬丹毒是一種自然疫源性疾病，其傳染源主要包括病豬和帶菌豬的分泌物、排泄物及死豬污染的飼料、飲水、土壤等[2];這不僅對世界各地畜禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟造成了巨大損失，而且還嚴(yán)重危害了人類的健康[3]。目前，已有多種滅活疫苗和弱毒疫苗用于預(yù)防豬丹毒的流行，雖然這些疫苗的應(yīng)用對預(yù)防和控制豬丹毒的暴發(fā)確實起到一定的積極作用，但由于豬丹毒絲菌有較多的血清型，使得疫苗的免疫保護效果存在嚴(yán)重的局限性，因此研制安全高效的疫苗是目前對控制豬丹毒流行較為有效的手段[4]。

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，利用生物信息學(xué)軟件對所獲得的生物信息數(shù)據(jù)進行分析已是常用的方法[4]。迄今為止，已有很多研究者通過生物信息學(xué)的方法對所獲得的數(shù)據(jù)進行分析預(yù)測[5]，本研究通過生物信息學(xué)相關(guān)軟件對豬丹毒絲菌強毒、弱毒菌株的表面蛋白抗原A（surfactant proteins antigen A，SpaA）基因序列進行同源性分析及結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ?，從而對SpaA基因指導(dǎo)的蛋白質(zhì)一、二、三級結(jié)構(gòu)及B細胞表位進行預(yù)測，對比豬丹毒絲菌弱毒菌株和野生強毒菌株之間的差異，試圖對弱毒菌株減毒原因進行分析，以期為SpaA蛋白作為豬丹毒絲菌亞單位疫苗的候選抗原提供理論依據(jù)，同時也為豬丹毒桿菌SpaA蛋白功能研究提供線索[5]。

1 材料與方法

1.1 菌株

從廣東地區(qū)分離得到的豬丹毒絲菌野外分離株SG7，經(jīng)動物試驗鑒定為強毒株。豬丹毒絲菌弱毒株GC42，從廣西麗原生物股份有限公司的豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯(lián)活疫苗中分離得到。

1.2 SpaA基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增與測序

按照SpaA（EF688017）的基因序列及載體多克隆位點，運用Primer Premier 5.0軟件來設(shè)計特異性引物的序列，在引物序列的5′端上插入2個酶切位點，分別為BamHⅠ酶切位點與EcoRⅠ酶切位點。上游引物SpaA-1：5′-CGCGGATCCATGAAAAAGAAAAAACACC-3′。下游引物SpaA-2：5′-CCGGAATCCCTATTTTAAACTTCCATCGT-3′。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物連接載體后再送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA基因的理化性質(zhì)分析

通過ExPASy服務(wù)器來分析豬丹毒絲菌SpaA基因的性質(zhì);通過Prot Param來分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成、相對分子質(zhì)量、等電點等物理化學(xué)性質(zhì);通過SignalP 4.0來預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽。

1.4 豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過ExPASy服務(wù)器上的SOPMA方案進行預(yù)測豬丹毒桿菌SpaA蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.5 豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA基因結(jié)構(gòu)域和功能預(yù)測

使用NCBI中的CDD（Conserve Domain Database）數(shù)據(jù)庫對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA基因序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.6 豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL構(gòu)建豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.7 豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白B細胞表位的預(yù)測

通過DNAStar軟件對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)的親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性等各方面的參數(shù)進行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬丹毒絲菌SpaA基因PCR擴增結(jié)果

擴增結(jié)果由圖1可知，SG7菌株的SpaA基因全長為1 881 bp，GC42菌株的SpaA基因全長為1 641 bp，缺失240 bp。

2.2 豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA基因序列翻譯結(jié)果

SpaA基因序列翻譯結(jié)果由圖2可知，由于GC42菌株相比SG7菌株而言缺少一段氨基酸序列，缺少的這段氨基酸序列在豬丹毒絲菌SG7氨基酸序列的 463～543 區(qū)段。利用 ExPASy 和 SOPMA在線軟件對這一段氨基酸序列進行分析，結(jié)果顯示，缺失的這段氨基酸序列含有80個氨基酸，相對分子量為9 259.59，理論等電點（PI）為9.70，親水性的平均值（GRAVY）為-0.714，即缺失的這一段氨基酸形成的蛋白質(zhì)為親水性的堿性蛋白質(zhì)。同時，豬丹毒絲菌SG7的氨基酸序列與豬丹毒絲菌GC42的SpaA基因氨基酸序列還存在單個氨基酸差異，其中，在203的氨基酸位點中，豬丹毒絲菌SG7的氨基酸為甲硫氨酸，而豬丹毒絲菌GC42的氨基酸為異亮氨酸，這一變化可能導(dǎo)致豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)較松散，在461位點中豬丹毒絲菌SG7的賴氨酸在豬丹毒絲菌GC42中被替換成天冬酰胺，這一替換可能會影響豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)的等電點。

2.3 理化性質(zhì)分析

利用ExPASy（http：//expasy.org/tools/protparam.html）在線軟件對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行預(yù)測分析可知，豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白質(zhì)共有626個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子量為72 289.85，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)共有546個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子量為63 037.24，豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白的氨基酸數(shù)量差異見表1，其中賴氨酸、酪氨酸和色氨酸均有明顯差異;根據(jù)理論的等電點值分析可知，豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白質(zhì)理論等電點為8.82，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)理論等電點為7.61，其中，豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白質(zhì)為堿性蛋白質(zhì)，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)則為中性蛋白質(zhì)。

2.4 蛋白質(zhì)親疏水性分析

利用ExPASy在線軟件對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)親水系數(shù)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白質(zhì)親水性的平均值為-0.568，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)親水性的平均值為-0.552;豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)均表現(xiàn)為親水性，其中豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)親水性較弱。

2.5 蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測

信號肽是一種位于分泌蛋白的N端并引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的肽鏈，對于外泌蛋白的分泌起主導(dǎo)作用[5]，采用ExPASy中的SignalP 4.0分析豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)的氨基酸序列信號肽的存在位置及序列，結(jié)果（圖3）顯示，豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)氨基酸序列上信號肽的剪切位點均位于第 28～32個氨基酸（圖3-a為豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白質(zhì)的氨基酸序列信號肽，圖3-b為豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)的氨基酸序列信號肽）。

2.6 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA在線軟件對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，分析結(jié)果由表2可知，各組成所占百分比表現(xiàn)為α螺旋>無規(guī)則卷曲>延伸鏈>β轉(zhuǎn)角;其中α螺旋是豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白氨基酸序列減少最多的結(jié)構(gòu)，其次是延伸鏈。

2.7 結(jié)構(gòu)域和功能預(yù)測

使用NCBI中CDD數(shù)據(jù)庫對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)的進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示，豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)在羧基端（446～625）均存在一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域為葡聚糖結(jié)合域，預(yù)測為該保守的重復(fù)結(jié)構(gòu)域?qū)儆贜-乙?；邗?L-丙氨酸酰胺酶家族蛋白， 同時，根據(jù)吾魯木汗·那孜爾別克等通過被動免疫試驗證實了豬丹毒絲菌的SpaA蛋白中主要免疫保護效應(yīng)的核心區(qū)段為氨基端（88～431）[6]，但豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白缺少的氨基酸序列位于豬丹毒絲菌SG7的氨基酸序列區(qū)段的羧基端（463～543），因此這一缺失對蛋白氨基端所引起的免疫保護并無太大影響。

2.8 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SWISS-MODEL構(gòu)建了2種蛋白質(zhì)的模型，由圖4可知，豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白模型主要由β-折疊分布在表面，由無規(guī)則卷曲連接形成，且整體結(jié)構(gòu)均較為緊密，而豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白模型主要由3條α-螺旋通過無規(guī)則卷曲連接形成，排列相對松散。

2.9 B細胞表位的預(yù)測

通過DNAStar軟件對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)的親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性等各方面參數(shù)進行預(yù)測，由圖5、圖6可知，雖然B細胞抗原表位的數(shù)量及抗原表位出現(xiàn)的肽段可能有所不同（表3），但豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白的氨基酸序列均在193～206、217～231、290～309、313～327、328～376、386～457間的這些區(qū)段在各方案所預(yù)測的參數(shù)值均高于其他區(qū)段，因此這幾個區(qū)段具有較高形成B細胞表位的可能性。

3 討論

免疫原性是指能引起免疫應(yīng)答的性能，一般包括多糖和蛋白質(zhì)。一種物質(zhì)的免疫原性強弱受多方面的影響，包括該物質(zhì)自身的性質(zhì)、異種性、宿主遺傳性等。具有免疫原性的物質(zhì)分子量越大， 免疫原性就越強，而在所有含有大量芳香族氨基酸尤其含有酪氨酸且具有免疫原性蛋白質(zhì)分子中，其免疫原性更強。本研究中，由于豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白缺少一段含有80個氨基酸的序列，從而使豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)在相對分子質(zhì)量和氨基酸數(shù)量組成上與豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白質(zhì)相比有所差異，這使2株菌株引發(fā)機體產(chǎn)生的免疫原性的強弱不同;根據(jù)這2株菌株的結(jié)構(gòu)域分析，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白雖缺少一段氨基酸序列，但豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白缺少的氨基酸序列位于豬丹毒絲菌SG7的氨基酸序列區(qū)段的羧基端（463～543），而豬丹毒絲菌的SpaA蛋白中起主要免疫保護效應(yīng)的核心區(qū)段為氨基端（88～431）[6]，因此這一缺失對蛋白氨基端引起的免疫保護并無太大影響。這些分析結(jié)果表明，豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，即2株菌株均具有引起機體免疫應(yīng)答的免疫原性;根據(jù)理化性質(zhì)分析，豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白氨基酸在序列數(shù)量上有所差異，其中差異較明顯的氨基酸為賴氨酸、酪氨酸和色氨酸;豬丹毒絲菌SG72的SpaA蛋白質(zhì)中賴氨酸、酪氨酸和色氨酸的數(shù)量明顯高于豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)，豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)相對分子量的大小表現(xiàn)為SG7>GC42，這些分析結(jié)果均表明，豬丹毒絲菌SG72的SpaA蛋白質(zhì)可能比豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)具有更強的免疫原性。

我們通常把病原菌的致病性強弱程度稱為細菌的毒力，主要包括病原菌的侵襲力和病原菌產(chǎn)生的毒素，產(chǎn)生的毒素主要包括內(nèi)毒素和外毒素，化學(xué)本質(zhì)為多糖和蛋白質(zhì);蛋白質(zhì)抗原與其在機體所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體特異性結(jié)合的能力稱為抗原性，一般來說，細菌毒力的強弱與抗原性的強弱呈正相關(guān)[7]，蛋白質(zhì)抗原在機體中抗原性的強弱受抗原分子大小、化學(xué)組成成分、抗原決定簇結(jié)構(gòu)、抗原與被免疫動物親緣關(guān)系遠近等各方面的影響，抗原分子的立體結(jié)構(gòu)不僅是決定抗原分子與淋巴細胞抗原受體結(jié)合、引起免疫應(yīng)答功能的關(guān)鍵，而且決定著抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，同時還是出現(xiàn)各種免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)又由氨基酸序列所決定，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)由于缺失一段氨基酸序列，從而使豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)相對豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白質(zhì)有明顯差異;豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白氨基酸序列相比豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白氨基酸序列來說，α螺旋的數(shù)量減少最多且α螺旋含量減少，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)含量均呈現(xiàn)增加趨勢，這可能使豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)構(gòu)象變得更為松散和伸展，從而對蛋白質(zhì)的抗原性有影響。豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)模型分析結(jié)果表明，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)相比豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白的立體結(jié)構(gòu)更為松散些，這一空間結(jié)構(gòu)的差異可能導(dǎo)致了抗原表位的掩蓋[8]。其中，蛋白質(zhì)中的α-螺旋含量與抗原性的強弱呈明顯正相關(guān)[8];因此可以推測，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)中α-螺旋含量的減少及豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致抗原表位結(jié)構(gòu)松散，從而導(dǎo)致豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白質(zhì)在機體的抗原性比丹毒絲菌SG7的SpaA基因蛋白質(zhì)在機體的抗原性弱，從而使豬丹毒絲菌GC42菌株在機體中呈現(xiàn)出毒力相對豬丹毒絲菌SG7菌株較弱的現(xiàn)象，表現(xiàn)出豬丹毒絲菌GC42的弱毒菌株特性。

蛋白質(zhì)的抗原性并不是取決于整個蛋白質(zhì)分子，而是取決于其與抗體分子結(jié)合的特異性化學(xué)基團，即抗原表位，因此通過對豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)的親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性等各方面參數(shù)進行預(yù)測，可尋找具有形成B細胞表位的較高可能性的氨基酸區(qū)段。根據(jù)分析預(yù)測，豬丹毒絲菌SG7和GC42的SpaA蛋白質(zhì)的氨基酸序列均在193～206、217～231、290～309、313～327、328～376、386～457之間，這幾個區(qū)段在各方案所預(yù)測的參數(shù)值均高于其他區(qū)段，極可能形成B細胞表位。這些分析可以表明，豬丹毒絲菌GC42的SpaA蛋白雖然因缺少一段氨基酸，相對豬丹毒絲菌SG7的SpaA蛋白而言，預(yù)測抗原表位稍有差異，但絕大多數(shù)的抗原表位預(yù)測均是相同的，即2個菌株抗原表位可能并未改變，這為豬丹毒絲菌基因工程亞單位疫苗打下了堅實的基礎(chǔ)[9]。

參考文獻：

[1]盧 琴，李明波，彭先文，等. 豬丹毒桿菌SpaA基因的生物信息學(xué)分析[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2015，36（9）：23-27.

[2]曹文堯，李江偉，呂芳等. 丹毒絲菌SpaA基因免疫保護區(qū)的克隆與功能研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)報，2007，29（7）：496-500.

[3]吾魯木汗·那孜爾別克，張 磊，何翠等. 豬丹毒絲菌天然SpaA和重組SpaA-N免疫保護效果的評價[J]. 微生物學(xué)報，2010，50（3）：367-372.

[4]林 琳，江 斌，吳勝會，等. 豬丹毒桿菌SpaA基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（8）：1232-1236.

[5]冷非凡，羅 文，李淵利，等. 嗜鐵鉤端螺旋菌中鐵硫簇相關(guān)蛋白的生物信息學(xué)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（12）：5296-5303.

[6]吾魯木汗·那孜爾別克，劉祝祥，李 科，等. 豬丹毒絲菌C43311株SpaA基因N端免疫保護區(qū)的克隆和表達[J]. 微生物學(xué)報，2008，48（2）：207-212.

[7]張煥容. 副豬嗜血桿菌抗原性研究進展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（7）：91-94.

[8]朱業(yè)培，王 瑋，呂青骎，等. 超高壓協(xié)同溫度處理對過敏原Bosd6抗原性及二級結(jié)構(gòu)的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，39（4）：668-672.

[9]李偉杰，趙 耘，康 凱，等. 紅斑丹毒絲菌SpaA抗原基因的克隆、序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2011，31（11）：1631-1634，1639.