魏利超 吳 旻

血管平滑肌細胞(VSMCs)是正常血管壁結構的主要細胞成分，它能夠通過協(xié)調血管的舒張和收縮功能而維持血管的張力和彈性，從而在調節(jié)血流量和血壓的過程中發(fā)揮作用；心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與血管平滑肌細胞的功能改變密切相關[1]。血管壁的形態(tài)和結構并不是固定的，而血管壁重塑的重要細胞基礎是VSMCs，當血管接受到生物信號或化學刺激時，VSMCs通過分泌的細胞外基質(ECM)維持基本的血管功能[2]。VSMCs表型的轉化主要導致其結構和功能的改變，這種結構和功能的改變在動脈粥樣硬化癥、高血壓和血管成型術后再狹窄等大多數心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮了關鍵的作用[3]。

核因子KappaB(NF-κB)是一種在真核生物細胞內普遍表達的轉錄因子，最初被發(fā)現時是一種可以與免疫球蛋白κ輕鏈基因的κ增強子結核的B細胞核蛋白。NF-κB含有一個由300個氨基酸構成的高度保守的N-末端區(qū)域，稱為Rel-同源結構域(RHD)[4]。通過該結構域，不同的NF-κB成員可以相互作用形成各種同源或者異源二聚體并與靶基因的啟動子或增強子區(qū)域中的κB序列元件結合，進而參與對靶基因的調節(jié)[5]。研究表明，NF-κB被激活后，即通過信號轉導途徑啟動一系列聯(lián)式翻譯，可以促進多種細胞因子、黏附因子、化學因子和生長因子等的表達[6～9]。本研究通過上調NF-κB來研究其對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響，為治療動脈粥樣硬化、血管成形術后在狹窄和其他血管增殖性病變提供新思路。

材料與方法

1.材料:人主動脈平滑肌細胞HA-VSMC購自中國科學院細胞庫；質粒小提試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生物公司；Opti-MEM?和DMEM購自美國Gibco公司；L-谷氨酰胺購自中國Solarbio公司；超敏發(fā)光液購自美國Thermo Fisher Scientific公司；MTT細胞增殖試劑盒購自凱基生物；Lipofectamine?3000 購自美國Invitrogen公司；鼠單克隆抗體GAPDH購自中杉金橋公司；兔單克隆抗體NF-κB p65購自英國Abcam公司；NovoCyteTM流式細胞儀NovoCyte 2060R購自艾森生物(杭州)有限公司；蛋白垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司；超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

2.載體構建：NCBI查找NF-κB基因的CDS序列，引入酶切位點(BstBI/BamHI)送通用生物合成cds區(qū)基因片段(克隆至plvxpuro載體)。質粒NF-κB-plvxpuro轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)過夜，抽提質粒并酶切驗證。

3.實驗分組：載體轉染HA-VSMC細胞實驗分為3組，即對照組、空載組和NF-κB過表達組。接種細胞至80%匯合度時轉染，前一天接種或換液，取出質粒，使用Opti-MEM?培養(yǎng)基稀釋，制備質粒DNA預混液，充分混勻。避光室溫孵育5min。使用Opti-MEM?培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine?3000試劑-充分混勻，避光室溫孵育5min。在每管已稀釋的Lipofectamine?3000試劑中加入稀釋的質粒DNA，室溫避光孵育1h。加入DNA-脂質體復合物至細胞中。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育細胞。

4.MTT檢測各組細胞的增殖情況:將HA-VSMC細胞接種于96孔板培養(yǎng)(約2×103個/孔)，置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；按照要求在相應的實驗分組中加入NF-κB抑制劑IMD-0354；將96孔板在37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育48h；將5×MTT用Dilution Buffer稀釋成1×MTT；每孔加50μl 1×MTT，在37℃孵育4h，使MTT還原為甲臢；吸出上清液，每孔加150μl DMSO使甲臢溶解，用平板搖床搖勻；酶標儀在550nm波長處檢測各孔的吸光度。

5.流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況：將細胞接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%～70%時，按實驗分組進行操作，48h后，離心收集各組細胞，細胞量為5×105個/組。用雙蒸水稀釋5×Binding Buffer為1×工作液，取500μl 1×Binding Buffer 重懸細胞。每管加入 5μl Annexin V-FITC 輕柔混勻后加入10μl PI，緩慢渦旋混勻后于室溫下避光孵育5min。在流式細胞儀上，通過FITC檢測通道(通常為FL1)檢測Annexin V-FITC(Ex=488nm；Em=530nm)和通過PE檢測通道(通常為FL2)檢測 PI。

6.蛋白質印跡法檢測各組細胞NF-κB的表達情況:收集轉染72h后的各組細胞，用PBS洗滌細胞3次，加入細胞裂解液，冰上裂解30min后，4℃下10000r/min離心10min，小心吸取上清，獲得各組細胞總蛋白。根據BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性后上樣，再進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2h后濕法轉膜30～50min。4℃孵育一抗過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2h。最后通過滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。利用Quantity One軟件進行各抗體條帶灰度值的分析。

結 果

1.人主動脈平滑肌細胞的培養(yǎng):HA-VSMC培養(yǎng)的細胞的生長狀態(tài)良好，詳見圖1。

圖1 日常細胞培養(yǎng)顯微鏡拍照(×100)

2.NF-κB過表達載體鑒定結果:用BstBI/BamHI對抽提的質粒NF-κB-plvxpuro進行雙酶切(圖2)，條帶與理論值相符，證明質粒NF-κB-plvxpuro為正確質粒。

圖2 酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶

3.NF-κB過表達載體轉染驗證:與對照組比較，NF-κB過表達組的NF-κB的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 NF-κB過表達載體轉染驗證

4.MTT檢測細胞增殖的結果:用MTT法檢測各組HA-VSMC不同時間點的增殖情況，與對照組比較，NF-κB過表達組細胞的增殖率一直處于較低水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 MTT檢測細胞增殖的結果

5.流式檢測細胞凋亡結果：流式細胞儀檢測各組HA-VSMC細胞的凋亡情況，與對照組比較，NF-κB過表達組細胞凋亡明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果

討 論

近年來，我國心腦血管疾病發(fā)生率不斷增長，初步估計2016年我國心腦血管疾病患者人數約為2.9億，心腦血管疾病死亡人數占居民疾病死亡人數40%以上，位居首位，高于腫瘤及其他疾病。心腦血管疾病已成為危害我國居民身體健康的重大疾病[10]。越來越多的研究表明，血管平滑肌細胞在血管壁發(fā)生病變時扮演著重要的角色[11]。轉錄因子NF-κB是一種調節(jié)炎癥和免疫相關基因的轉錄因子[12，13]。已有研究證明NF-κB可以通過誘導microRNA從而影響血管平滑肌細胞的增殖與遷移[14]。

本研究目的旨在研究活化的NF-κB對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響，通過構建NF-κB過表達載體來上調NF-κB的表達，通過MTT法和流式細胞儀來檢測各組HA-VSMCs的增殖和凋亡情況。MTT結果顯示,與對照組細胞比較，NF-κB過表達組細胞的增殖率一直處于較低水平，說明NF-κB被激活可以抑制HA-VSMC增殖。為驗證MTT的結果，利用流式細胞儀來檢測各組HA-VSMCs的凋亡情況，結果發(fā)現NF-κB過表達組細胞較正常對照組細胞的凋亡率偏高，其結果與MTT檢測的結果一致，得出過表達NF-κB可以促進HA-VSMC凋亡，WB檢測各組HA-VSMC細胞NF-κB表達情況，結果驗證NF-κB過表達組作用于HA-VSMC細胞可以提高NF-κB的表達。

多項研究表明，NF-κB通路的激活介導TNF-α、IL-1和IL-6等促炎性因子的轉錄以及各種趨化因子的產生。這些可溶性因子與其特異性受體結合，誘導血管舒張以及單核細胞和中性粒細胞向炎癥部位的遷移[15，16]。關于NF-κB介導的炎性反應在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中的作用值得進一步探討。本實驗未做深入探究，這也是本研究的不足之處。血管平滑肌細胞的異常增殖是高血壓、動脈粥樣硬化等許多心腦血管病的主要病理特征，然而涉及參與其異常增殖、分化、遷移等過程相關分子機制卻一直未見闡明。

綜上所述，本研究通過對過表達NF-κB會抑制血管平滑肌細胞的增殖并促進血管平滑肌細胞的凋亡，為心腦血管疾病的基因靶向治療的研究提供了方向。在后續(xù)研究中，對NF-κB影響血管平滑肌細胞增殖和凋亡機制進行深入探討，為闡明血管平滑肌細胞異常增殖、分化、遷移等過程，也為治療動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄和其他心腦血管增殖性病變提供新思路。