吳 梅 丁 偉 唐 亮

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是起源于鼻咽上皮的頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，東南亞和我國(guó)南部的珠江三角洲地帶是高發(fā)區(qū)[1]。生活習(xí)慣、遺傳和病毒感染被認(rèn)為是3個(gè)重要的發(fā)病因素[2]。鼻咽癌具有易轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，包括區(qū)域淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是患者死亡的主要原因，也是臨床治療的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題[3]。篩選出鼻咽癌轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)基因，針對(duì)性靶向干預(yù)是攻破轉(zhuǎn)移的重要思路。

多梳基因蛋白家族(polycomb group of protein，PcG)與器官發(fā)育，細(xì)胞的增殖及分化調(diào)控，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。其中人多梳蛋白2(human polycom 2,HPC2)又稱(chēng)為染色盒同源物4(chromobox homolog 4, CBX4)是PcG家族核心成員之一，常與RING1等其他PcG蛋白形成復(fù)合體，抑制homeotic基因，維持重要的生理功能[5]。據(jù)相關(guān)研究顯示，HPC2與多種腫瘤預(yù)后相關(guān)，筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPC2表達(dá)是影響NPC放療預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而HPC2在鼻咽癌中的生物學(xué)功能尚不清楚，本研究旨在初步探討HPC2在鼻咽癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用和分子機(jī)制。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象:人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F由江西省委腫瘤轉(zhuǎn)移與精準(zhǔn)治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。RPMI1640、Optimum培養(yǎng)基和 RNAi Max 均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。陰性對(duì)照 siRNA 及 HHPC2 靶序列siRNA 購(gòu)自廣州銳博生物公司，#1siRNA 序列(正義鏈)5′-AGAUGAAGAUAGUCAAGAA-3′,(反義鏈)5′-UUCUUGACUAUCUUCAUCU-3′；#2siRNA序列(正義鏈)5′-AGUACGAGCUCAACAGCAA-3′,(反義鏈)5′-UUGCUGUUGAGCUCGUACU-3′；scrambled 為無(wú)干擾功能對(duì)照序列。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：從液氮復(fù)蘇的5-8F細(xì)胞，接種于10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃的恒溫箱培養(yǎng)。先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的6孔板，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染日能夠達(dá)到約60%融合度。采用RNAi max進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染無(wú)功能scrambled 序列的對(duì)照組和兩個(gè)特異性靶向HPC2的轉(zhuǎn)染組(#1siRNA和#2siRNA組)。于6孔板的每孔加入Optimum無(wú)血清培養(yǎng)基1.5ml，各孔用EP管配制如下轉(zhuǎn)染混合體系，A管：Optimum 250μl + RNAimax 5μl，輕柔混勻孵育5min;B管：Optimum 250μl +siRNA 5μl，輕柔混勻孵育5min，A加入到B管中，混勻后室溫孵育20min。緩慢滴加入相應(yīng)孔中，6孔板輕微晃動(dòng)搖勻。轉(zhuǎn)入5%CO2、37℃孵育箱，6h后換液，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24～48h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.PCR及Western blot 法檢測(cè)HPC2的siRNA干擾效率：簡(jiǎn)要步驟如下，TRIzol法提取細(xì)胞系總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。引物均購(gòu)自中美泰和生物公司。HPC2引物：Forward 5′-GCAGAGTGGAGTATCTGGTGA-3′，Reverse 5′-AGCTTGGCACGGTTGTCAG-3′；GAPDH引物：Forward 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，Reverse 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。先行RT-PCR，總反應(yīng)體系50μl，95℃，預(yù)變性15min，95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，上樣緩沖液2μl，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，65V，30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照電泳結(jié)果。SYBR?Green mix(TaKaRa生物公司)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)的條件同前，擴(kuò)增產(chǎn)物用2-ΔΔCt法計(jì)算，與內(nèi)參基因GAPDH校準(zhǔn)得到檢測(cè)樣本的相對(duì)表達(dá)水平。

4.蛋白免疫印跡(Western blot)法：檢測(cè)轉(zhuǎn)染 siRNA-HPC2 后的5-8F 細(xì)胞的HPC2及EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)，簡(jiǎn)述如下：RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量，試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司(Cat.no，23227)；配平后用4×的上樣緩沖液煮蛋白，按照每孔30μg上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，將膠上蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，PBST洗膜，配一抗：HPC2(Cat.no，A302-355A；Bethly，1∶1000)，Snail(Cat.no，#3879；CST，1∶1000)，E-cadherin(Cat.no，#3195；CST，1∶1000)，MMP9(Cat.no，#3852；CST，1∶1000)和內(nèi)參β-actin(Cat.no，AP0060；Bioworld，1∶2000)，加至孵育盒的膜上，4℃ 孵育過(guò)夜，PBST洗膜，加 1∶10000稀釋的二抗室溫孵育1h，搖床洗膜，ECL(Cat no.P0018F，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)化學(xué)發(fā)光后顯影，用Image lab軟件采集圖像，β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期5-8F細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/個(gè)，鋪6孔板，每孔均勻鋪80%，用一次性20μl無(wú)菌移液吸頭勻速用力劃痕，用PBS洗去劃落的細(xì)胞，加入10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，每間隔6h拍照，鏡下測(cè)量各組細(xì)胞遷移距離，愈合率%=(0h劃痕距離-各測(cè)量時(shí)點(diǎn)劃痕距離)/0h劃痕距離。

6.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：在有Matrigel膠的Transwell 小室中加入50μl 無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中30 min，用于水化基膜，取消化后重懸的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/孔接種到上室中，在下室中加入500μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用PBS洗兩遍，甲醇固定下室20min，再用PBS洗2遍，1%結(jié)晶紫染色10min，緩慢流水中漂洗1min，晾干，高倍光鏡下統(tǒng)計(jì)穿過(guò)Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)目。

結(jié) 果

1.siRNA轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細(xì)胞HPC2的mRNA及蛋白表達(dá)：5-8F細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后HPC2的mRNA豐度明顯降低(圖1A)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示,對(duì)照組HPC2的mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.93±0.06，#1 siRNA組表達(dá)量為0.20±0.05，#2 siRNA組表達(dá)量為0.18±0.04。轉(zhuǎn)染組的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。HPC2的蛋白水平也明顯降低(圖1C)。

圖1 在鼻咽癌5-8F細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向HPC2的siRNA后HPC2的mRNA和蛋白水平檢測(cè)

2.HPC2沉默后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞劃痕愈合的影響：用平板劃痕實(shí)驗(yàn)比較HPC2沉默后細(xì)胞遷移愈合能力的變化。對(duì)照組6、12、24h的愈合率分別為30.43%±1.83%、64.75%±3.36%、97.32%±2.54%；#1 siRNA組6、12、24h的愈合率分別為22.43%±2.57%、48.75%±2.76%、75.46%±2.28%；#2 siRNA組6、12、24h的愈合率分別為18.65%±3.07%、37.51%±2.12%、68.72%±2.62%。在6、12、24h時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，沉默組的劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 沉默HPC2基因?qū)?-8F細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

3.沉默HPC2后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力的影響：用Transwell小室檢測(cè)比較5-8F細(xì)胞侵襲能力，72h后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為320±32，#1siRNA-HPC2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)為190±28，#2siRNA-HPC2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)為138±21。與對(duì)照組比較，siRNA-HPC2沉默組的細(xì)胞穿膜數(shù)減少，侵襲性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 沉默HPC2后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫，×100)

4.靶向沉默HPC2后對(duì)EMT信號(hào)通路的影響：轉(zhuǎn)染HPC2對(duì)5-8F細(xì)胞中EMT關(guān)鍵分子Snail、E-cadherin及MMp9表達(dá)的影響。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，兩個(gè)siRNA-HPC2轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)錄因子Snail下調(diào)，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)移標(biāo)志物MMP9下調(diào)，提示HPC2沉默后5-8F細(xì)胞的EMT信號(hào)通路抑制，轉(zhuǎn)移活性下降。

圖4 HPC2靶向沉默后EMT通路關(guān)鍵分子Snail、E-cadherin、MMP9的變化

討 論

骨、肺、肝臟是鼻咽癌(NPC)最常見(jiàn)轉(zhuǎn)移部位。骨轉(zhuǎn)移以骨盆、脊柱、四肢骨常見(jiàn)。約25%的T4或N3期的患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。EBV介導(dǎo)的NPC轉(zhuǎn)移及調(diào)控機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)[7～9]。NPC的5-8F細(xì)胞株是持續(xù)感染EB病毒的SUNE1細(xì)胞株的亞株，具有高轉(zhuǎn)移特性[10]。因此，5-8F是關(guān)于鼻咽癌轉(zhuǎn)移研究的理想細(xì)胞模型。

1997年Otte等首次發(fā)現(xiàn)HPC2基因，定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂的25.3位置，由560個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約61kDa。HPC2是一種低分子泛素修飾物，稱(chēng)為泛素連接酶SUMO E3，它包含如下3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：①氨基端染色質(zhì)區(qū)域介導(dǎo)Pc蛋白與染色質(zhì)結(jié)合；②位于羧基端的COOH盒，可以與RING1和核小體顆粒結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制；③位于羧基端與伴侶分子CtBP特異結(jié)合的6氨基酸基序[11]。CBX4的SUMO化作用可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，也可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。HPC2的轉(zhuǎn)錄本在人體正常組織中差別不大，但在不同腫瘤細(xì)胞株中存在較大差異，HPC2在骨肉瘤細(xì)胞、腸癌細(xì)胞表達(dá)量高，在Burkitt淋巴瘤中表達(dá)量卻很低[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPC2在鼻咽癌組織及5-8F細(xì)胞株有較高表達(dá)。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，CBX4在不同腫瘤中的作用并不一致。在結(jié)直腸癌中，CBX4募集HDAC3到RUNX2啟動(dòng)子抑制其轉(zhuǎn)錄，從而抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[14]。研究顯示，CBX4的癌基因樣促轉(zhuǎn)移作用，在腎透明細(xì)胞癌中，CBX4與HDAC1作用抑制KLF6抑癌基因啟動(dòng)子活性，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移；在骨肉瘤中CBX4上調(diào)RUNX2促進(jìn)其轉(zhuǎn)移，靶向CK1α/CBX4有望使伴有轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者獲益；通過(guò)Notch1信號(hào)通路增強(qiáng)乳腺癌侵襲性；促進(jìn)肝細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移株MHCC97L的遷移與肺轉(zhuǎn)移；調(diào)控BMI1促進(jìn)肺癌增殖進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[15～19]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默HPC2后，鼻咽癌細(xì)胞侵襲遷移能力降低，提示HPC2在NPC中可能具有促轉(zhuǎn)移作用。EMT通路是調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的經(jīng)典下游信號(hào)通路，腫瘤驅(qū)動(dòng)基因介導(dǎo)EMT通路是促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的重要途徑。Dong等[20]研究顯示，下調(diào)MLKL通過(guò)抑制EMT有效抑制鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)沉默HPC2表達(dá)，snail下調(diào)，上皮標(biāo)志物上調(diào)，轉(zhuǎn)移標(biāo)志物MMP9下調(diào)，提示HPC2可能通過(guò)Snail/Ecadherin/MMP9通路介導(dǎo)NPC 轉(zhuǎn)移，具體的相互作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示在鼻咽癌5-8F細(xì)胞沉默HPC2表達(dá)，可抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需深入開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。以上證據(jù)支持HPC2可能作為治療鼻咽癌轉(zhuǎn)移的新分子靶點(diǎn)。