賈 雯 王 霞 柏歡歡 張文琦 謝戩芳

大動脈炎(takayasu arteritis，TA)是一種罕見的慢性系統(tǒng)性血管炎，主要累及主動脈及其一級分支。大動脈管壁的炎癥發(fā)生是TA的病理基礎，血管壁全層被炎性細胞浸潤是主要病理表現(xiàn)，多種炎性細胞和炎性因子參與了TA的發(fā)生、發(fā)展[1]。當機體受到感染、異常代謝產(chǎn)物等致病因素時，樹突狀細胞(dendritic cells,Dcs)被激活分化為不同的輔助性T細胞(T helper cells，Ths)參與TA發(fā)病[2]。Th17細胞是促炎細胞，Treg細胞是抑炎細胞，正常情況下Th17/Treg處于動態(tài)平衡。近年來多項研究表明，Th17/Treg比例失衡在自身免疫性疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3～5]。本研究通過檢測大動脈炎患者外周血Th17、Treg細胞及相關(guān)細胞因子的表達，探討其與疾病活動的關(guān)系。

對象與方法

1.研究對象：收集2016年3月～2019年5月于筆者醫(yī)院就診TA患者46例，患者年齡14～64歲，平均年齡35.45±11.02歲，男女性別之比為1∶4.8,病程0.08～35.83年，平均病程6.15±9.14年。符合美國風濕病學會1990年TA診斷標準[6]。同時收集43例來筆者醫(yī)院健康體檢者為健康對照組，年齡18～58歲，平均年齡43.30±10.77歲，男女性別之比為1∶7.6。病例組和對照組的年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.研究方法：記錄研究對象一般資料，收集發(fā)病癥狀、各項實驗室檢查資料，包括血小板(PLT)、補體(C)、血沉(ESR)、C反應蛋白(CRP)等，采用流式細胞儀技術(shù)(FCM)檢測正常人和患者外周血Th17細胞、Treg細胞表達水平；采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)(CBA)患者外周血IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α的濃度。檢測依據(jù)美國衛(wèi)生研究所NIH的標準判斷TA活動性[7]；根據(jù)NIS評分，≥2分定義為疾病活動組，<2分定義為非活動組。

3.主要設備及試劑：采用美國BD公司提供的FACS Calibur 流式細胞儀。Th17細胞和Treg細胞檢測使用試劑離子霉素、胎牛血清、1640液、高爾基阻斷劑、刺激素PMA購自美國Sigma公司。單克隆抗體IL-17-PE、CD4-FITC、CD25-APC、FOXP3-PE購自美國BD公司。IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α檢測使用試劑人Th1/Th2/Th17亞群試劑盒購自江西賽基生物技術(shù)有限公司。

4.Th17、Treg細胞檢測：抽取入選受試者外周血，采用流式細胞術(shù)檢測外周血Th17細胞和Treg細胞。(1)Th17細胞培養(yǎng)與標記：取80μl抗凝血分別加入刺激劑10μl PMA工作液、10μl Ionomycin工作液和1μl GolgiStop，37℃恒溫箱中培養(yǎng)5h。將其置于流式專用試管中，加入抗人CD4-FITC，室溫避光孵育30min后，加入新鮮配置的Fixation/Permeabilization液1ml渦旋混勻，4℃避光孵育30min后，加入抗人IL-17-PE，室溫避光孵育30min后，PBS洗滌，上機檢測。(2)Treg細胞標記：取80μl抗凝血加入CD4-FITC和CD25-APC，室溫避光孵育30min后，各管分別加入新鮮配置的Fixation/Permeabilization液1ml渦旋混勻，4℃避光孵育30min后，加入抗人FOXP3抗體，室溫避光孵育30min后，PBS洗滌后，上機檢測。(3)流式細胞儀測定：24h內(nèi)上流式細胞儀(Calibur, 美國BD公司)測定分析結(jié)果。根據(jù)前向角散射光(FSC)對側(cè)向角散色光(SSC)的散點圖對淋巴細胞設門區(qū)分淋巴細胞，以CD4對SSC設門區(qū)分Th細胞(CD4+)，取門內(nèi)10000個細胞，以CellQuest軟件獲取、分析相對百分數(shù)。(4)計算各促炎淋巴細胞之比。利用促炎淋巴細胞絕對計數(shù)之比算出Th17/Treg的比值。

5.細胞因子檢測：抽取入選患者外周血，采用CBA術(shù)檢測IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α的濃度。(1)采血后分離血清于-70℃保存?zhèn)溆?。標準曲線制備：用反應稀釋液將待測細胞因子標準品按照梯度法稀釋為5000、2500、1250、625、312、156、80、40、20、10、5和0pg/ml共12個質(zhì)量濃度。(2)混合微球制備：按每個測試每種微球1μl的量吸取捕獲微球混勻，成為混合捕獲微球，加0.5ml洗液以200g×5min離心，去上清，用血清捕獲微球稀釋重懸微球，并使終體積達50μl。按每個測試每種微球1μl的量混合PE標記的抗體，稀釋至終體積達50μl。取待測血清和標準品50μl置于上樣管，加入50μl混合捕獲微球，室溫避光孵育2h，離心，去上清，重懸，上機檢測。(3)以Bio-Plex 200閱讀器獲取細胞因子數(shù)據(jù)，以BioPlex Manager軟件測量熒光強度(MFI)和濃度(pg/ml)。

結(jié) 果

1.TA患者人口學信息、臨床癥狀及輔助檢查比較：TA活動組補體C3、補體C4、CRP、ESR、NIS評分均高于非活動組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TA活動組和非活動組的人口學信息、臨床癥狀比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表1)。

表1 TA患者人口學信息、臨床癥狀及輔助檢查

2.TA活動組、TA非活動組及健康對照組外周血Th17細胞、Treg細胞及Th17/Treg表達水平的比較：TA活動組、TA非活動組Th17細胞絕對計數(shù)與相對計數(shù)明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TA活動組Th17細胞絕對計數(shù)與相對計數(shù)高于非活動組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TA活動組、TA非活動組Treg細胞絕對計數(shù)與相對計數(shù)明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TA活動組Treg細胞絕對計數(shù)與相對計數(shù)低于非活動組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TA活動組、TA非活動組Th17/Treg明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TA活動組Th17/Treg高于非活動組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2)。

表2 3組外周血Th17、Treg細胞及Th17/Treg表達比較

3.TA活動組與非活動組患者細胞因子表達水平的比較：TA活動組IL-6、IL-17及TNF-α表達較非活動組明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TA活動組IL-10表達較非活動組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 TA患者血清細胞因子表達水平

4.細胞因子預測TA活動ROC曲線結(jié)果：以NIS評分為金標準，IL-6預測TA活動的AUC為0.806，最佳截斷點為10.125pg/ml，其敏感度為81.48%，特異性為68.75%；IL-10預測TA活動的AUC為0.694，最佳截斷點為8.490pg/ml，其敏感度為85.19%，特異性為56.25%；IL-17預測TA活動的AUC為0.704，最佳截斷點為7.565pg/ml，其敏感度為66.67%，特異性為75.00%；TNF-α預測TA活動的AUC為0.767，最佳截斷點為2.170pg/ml，其敏感度為81.5%，特異性為68.7%，詳見圖2。

圖2 細胞因子的ROC分析結(jié)果

討 論

大動脈炎是指累及主動脈及其主要分支的慢性非特異性炎癥，可引起的不同部位動脈狹窄或閉塞，少數(shù)也可引起動脈擴張或動脈瘤，出現(xiàn)相應部位缺血表現(xiàn)[8,9]。其發(fā)病機制與遺傳因素、內(nèi)分泌異常、感染后機體發(fā)生免疫功能紊亂以及細胞因子的炎性反應有關(guān)[10]。

調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)是T細胞中的一類重要亞群，能夠使機體保持免疫耐受功能從而抑制自身免疫病的發(fā)生。機體炎癥發(fā)生后，樹突狀細胞和巨噬細胞等抗原提呈細胞被活化誘導Treg細胞到達炎癥部位，通過分泌IL-10、TNF-α等抑制性細胞因子，下調(diào)自身反應性T細胞及炎性細胞因子表達，發(fā)揮免疫耐受從而維持機體自身免疫平衡。Th17細胞在自身免疫性疾病中主要發(fā)揮其致炎作用。Th17細胞及其相關(guān)細胞因子的過表達可趨向炎性細胞聚集于血管壁上，同時刺激成纖維細胞和巨噬細胞，誘導多種炎性細胞因子生成，造成炎癥反復發(fā)生及內(nèi)皮損傷從而導致動脈管壁增厚、血栓形成，嚴重者可發(fā)生狹窄及閉塞性病變[11]。

Th17細胞與Treg細胞在分化過程中密切相關(guān)，Th17細胞和Treg細胞在特定的細胞因子微環(huán)境下可以相互轉(zhuǎn)化，機體在免疫穩(wěn)定時，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的IL-10可抑制效應T細胞生成，促進Foxp3+Treg分化，維持自身免疫耐受；當機體存在炎性浸潤，激活的免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生IL-6、IL-17、TNF-α促進Th17細胞誘導炎性反應，同時抑制IL-10介導的Treg細胞生成。Th17/Treg平衡是機體自身免疫平衡的關(guān)鍵因素，促炎性Th17細胞和抑制性Treg細胞的比例失衡介導了多種血管炎癥自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展[12～14]。

本研究結(jié)果顯示，TA患者外周血Th17細胞相對計數(shù)和絕對計數(shù)明顯高于健康對照組，Th17/Treg比例高于健康對照組，Treg細胞相對計數(shù)及絕對計數(shù)低于健康對照組，且活動期患者Th17表達高于非活動期患者，Treg表達低于非活動期，其相應細胞因子也對應減少，推測TA發(fā)病與Th17細胞增多、Treg細胞減少所致Th17/Treg失衡相關(guān)。Misra等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TA患者的Th17細胞相對計數(shù)較健康對照組有增加，以及Th17細胞所分泌的細胞因子IL-17A表達上調(diào),這與筆者的研究結(jié)果相似。在TA患者體內(nèi)，促炎性Th17細胞增多，抑制炎性Treg細胞減少，Th17/Treg比例失衡，從而導致疾病發(fā)生。

本研究結(jié)果還顯示，活動期TA患者外周血IL-6、IL-17、TNF-α水平高于非活動期患者，IL-10水平低于非活動期患者。本研究進一步表明，IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α預測TA活動的AUC分別為0.806、0.694、0.704和0.767，具有一定的預測價值。IL-6、IL-17是Th17細胞分泌的促炎因子，其中IL-6是可促進T細胞激活加重炎性反應，是Th17分化過程中重要起始因子，從而調(diào)節(jié)Th17細胞和Treg細胞之間的平衡[16]。Savioli等[17]研究發(fā)現(xiàn)，活動期TA患者IL-6表達高于緩解期，這與筆者的研究結(jié)果相同。目前IL-6表達拮抗劑治療難治性大動脈炎已取得一定成效[18]。IL-17是強致炎因子，可以激活T細胞和刺激內(nèi)皮細胞、上皮細胞以及成纖維細胞參與TA炎癥，且IL-17與TNF-α具有協(xié)同作用,上調(diào)IL-6的表達,共同調(diào)節(jié)炎性反應[19]?；顒悠赥A患者IL-6、IL-17表達增多，提示Th17分泌的炎性細胞因子參與了TA的發(fā)展過程。IL-10是一種典型的抗炎細胞因子，主要由巨噬細胞和Treg細胞產(chǎn)生，IL-10具有多種免疫調(diào)節(jié)和炎性作用，可傳遞負反饋信號，抑制激活的免疫系統(tǒng)，抑制巨噬細胞的活化從而減少T細胞產(chǎn)生的細胞因子。本研究結(jié)果顯示，IL-10隨著疾病活動表達降低，與Treg細胞表達水平變化一致。提示可通過調(diào)控IL-10水平變化，抑制炎性因子分泌緩解TA病情活動。

綜上所述，Th17細胞表達上調(diào)、Treg 細胞表達下調(diào)、Th17/Treg 失衡參與了 TA的發(fā)生、發(fā)展過程。Th17、Treg 相關(guān)細胞因子IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α在TA活動期表達異常，有望成為臨床評估病情活動的重要標志物。本研究樣本量較小且為回顧性研究，建議開展大樣本隊列研究進一步探討 Th17/Treg 在活動期 TA發(fā)病過程中的作用。