李佳馨 李 鑫 吳建江 陳思宇 王 江

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)即由多種炎性介質(zhì)與效應(yīng)細(xì)胞共同參與，呈級(jí)聯(lián)放大的炎癥繼發(fā)性損傷和彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷。而心肌缺血/再灌注(ischemia reperfusion, I/R)損傷時(shí)氧化應(yīng)激釋放大量氧自由基及炎性細(xì)胞因子作用于肺部，是造成ALI的重要原因[1,2]。研究表明，缺血后處理(ischemic post-conditioning, IPostC)不僅對(duì)接受后處理的缺血/再灌注損傷的心肌有保護(hù)作用，而且對(duì)遠(yuǎn)隔器官肺也有相同效應(yīng)，而其緩解心肌I/R所致ALI，發(fā)揮圍術(shù)期肺保護(hù)的機(jī)制可能與抑制氧自由基積聚、減少炎性細(xì)胞因子釋放以及激活HIF信號(hào)通路相關(guān)[3,4]。然而，筆者的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下HIF信號(hào)通路受損更加嚴(yán)重[5]。此時(shí)IPostC圍術(shù)期肺保護(hù)作用是否存在及其發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制亟待進(jìn)一步闡明。此外，重組9型腺相關(guān)病毒rAAV9(recombinant adeno-associated virus-9, rAAV9)載體介導(dǎo)HIF-1α基因，可以外源性上調(diào)HIF-1α基因，修復(fù)糖尿病狀態(tài)下?lián)p傷的HIF信號(hào)通路。因此，本研究通過建立糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷模型及心肌缺血后處理模型，觀察炎性細(xì)胞因子、氧自由基以及HIF信號(hào)通路在心肌I/R致ALI病程進(jìn)展中的作用；探索外源性提高HIF-1α表達(dá)后IPostC對(duì)糖尿病心肌I/R致ALI的肺保護(hù)作用的機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：成年雄性糖尿病db/db小鼠40只，體質(zhì)量55～65g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(S組)、缺血/再灌注組(I/R組)、缺血后處理組(IPostC組)、rAAV9-HIF-1α+缺血后處理組(HIPostC組)，每組10只。

2.動(dòng)物模型制備：心肌缺血/再灌注損傷模型建立(I/R組)：小鼠腹腔注射氯胺酮(8mg/100g)、甲苯噻嗪(2mg/100g)和阿托品(0.12mg/100g)(即KXA混合液)麻醉，行氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸(頻率90～110次/分，潮氣量0.3～0.4ml)，小鼠仰臥固定于恒溫墊(36℃)操作臺(tái)上，消毒手術(shù)區(qū)域，雙目顯微鏡下于左側(cè)第3、4肋間開胸，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支缺血1h，位置為左心耳下緣約1mm處，后松開結(jié)扎線再灌注15min。結(jié)扎成功顯示心前區(qū)變白，心電圖示ST段抬高(T波高聳，QRS波增寬、變高)；再灌注成功標(biāo)志為ST段回落，心尖復(fù)紅。假手術(shù)組(S組)：相同部位開胸、穿線但不結(jié)扎。缺血后處理模型建立(IPostC組、HIPostC組)：缺血1h后，灌注5min、缺血5min連續(xù)重復(fù)3個(gè)循環(huán)，后再灌注15min；HIPostC組于缺血后處理前進(jìn)行尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α。

3.尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α：構(gòu)建重組病毒載體rAAV9-HIF-1α(美國Virovek公司)，從尾靜脈注射進(jìn)入db/db小鼠體內(nèi)，根據(jù)Chen等[6]研究，采用劑量為2.0×1011微克/只小鼠，并于4～5周后處死小鼠，以保證病毒注射最佳劑量和最優(yōu)表達(dá)時(shí)間。

4.肺組織病理學(xué)檢查：各組db/db小鼠建模完成后，取左肺于4%多聚甲醛中固定24h，石蠟包埋，HE染色采用蘇木素染液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)、伊紅染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，切片，×400鏡檢。肺損傷程度采用Smith評(píng)分體系綜合評(píng)定[7]。

5.炎性細(xì)胞因子檢測：采用流式微球捕獲芯片技術(shù)(CBA法)檢測促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)及抗炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)。

6.氧自由基檢測：采用丙二醛MDA試劑盒及超氧化物歧化酶SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別檢測脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)、氧自由基清除劑超氧化物歧化酶(SOD)。

7.Western blot法檢測：各組db/db鼠再灌注結(jié)束后，取右肺，快速液氮冷凍，后移入-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?，稱重取約100mg樣本加400μl RIPA裂解液(武漢博士德生物工程有限公司)，于冰上研磨充分混勻，4℃ 12000r/min離心15min取上清液提取蛋白。Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)測定蛋白濃度，后加入5×SDS-PAGE緩沖液，100℃水浴加熱5min使蛋白變性，12000r/min離心5min取上清待加樣。制膠、加樣、電泳后轉(zhuǎn)移至0.45μm PVDF膜上，室溫封閉1h，加入一抗HIF-1α抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司)，4℃孵育過夜，加入二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(英國Abcam公司)，室溫孵育1h，漂洗顯色后用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照。以HIF-1α條帶灰度值與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值的比值反映HIF-1α的表達(dá)。

結(jié) 果

1.肺組織形態(tài)學(xué)變化：光鏡下觀察，與S組比較，I/R組肺損傷程度顯著增高，表現(xiàn)為肺泡壁增厚、水腫、充血及出血，部分肺組織間質(zhì)細(xì)胞增生、增大且增多，胞質(zhì)深染，較多急慢性炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡萎縮、變小，肺組織大量出血、實(shí)變，部分細(xì)支氣管上皮細(xì)胞輕度增生；IPostC組缺血后處理后肺泡壁水腫、斷裂及出血情況僅有輕微緩解，但HIPostC組肺組織損傷程度顯著降低，肺泡壁結(jié)構(gòu)基本完整，出血情況顯著減少。提示糖尿病心肌缺血/再灌注致急性肺損傷模型建立成功，糖尿病狀態(tài)下，缺血后處理對(duì)心肌缺血/再灌注致急性肺損傷的肺保護(hù)作用不明顯，但結(jié)合rAAV9-HIF-1α后對(duì)于已受損肺組織確有一定的保護(hù)作用(圖1)。

圖1 db/db小鼠肺組織病理切片(HE，×400)

2.肺組織HIF-1α的表達(dá)：Western blot法結(jié)果顯示，與S組(0.449±0.030)比較，I/R組(0.549±0.025)和IPostC組(0.656±0.026)的肺組織HIF-1α含量升高(P<0.05)，與I/R組比較，IPostC組的肺組織HIF-1α含量升高(P<0.05)；與IPostC組比較，HIPostC組(0.702±0.064)的HIF-1α含量明顯增高(P<0.05)；提示在糖尿病心肌缺血/再灌注后急性肺損傷時(shí)HIF-1α表達(dá)受影響，單純應(yīng)用缺血后處理對(duì)于HIF-1α提高有幫助，而rAAV9-HIF-1α+缺血后處理可以明顯提高HIF-1α的含量(圖2)。

圖2 肺組織HIF-1α Western blot法條帶圖及柱狀圖

3.炎性細(xì)胞因子含量：與S組比較，I/R組和IPostC組的促炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，IPostC組的促炎性細(xì)胞因子含量降低，但與S組比較含量仍然很高(P<0.05)；而與IPostC組比較，尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后HIPostC組的促炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；與S組和I/R組比較，HIPostC組的抗炎性細(xì)胞因子IL-10的含量顯著增高(P<0.05)；提示單純應(yīng)用缺血后處理不能有效降低體內(nèi)炎性細(xì)胞因子含量，而rAAV9-HIF-1α+缺血后處理可以明顯降低體內(nèi)炎性細(xì)胞因子含量，通過抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生，減輕肺損傷(表1)。

表1 db/db小鼠各組炎性細(xì)胞因子含量

4.氧自由基含量：與S組比較，I/R組的MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與I/R組比較，IPostC組和HIPostC組的MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)；與S組和IPostC組比較，HIPostC組的MDA含量明顯降低(P<0.05)；脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA可反映氧自由基生成量，而氧自由基清除劑SOD可反映機(jī)體清除氧自由基的能力，MDA含量明顯升高而SOD活性降低，則提示缺血/再灌注損傷致急性肺損傷時(shí)體內(nèi)氧自由基含量顯著升高，缺血后處理可以減少ROS的生成，而尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后缺血后處理可以使ROS的生成更進(jìn)一步減少，從而發(fā)揮肺保護(hù)作用(表2)。

表2 db/db小鼠各組氧化應(yīng)激因子含量

討 論

急性肺損傷以炎性反應(yīng)失衡和血管通透性增加為主要病理特征，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥等[8]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血/再灌注損傷時(shí)心肌氧供不足，通過氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)釋放大量氧自由基和炎性細(xì)胞因子游走于全身，并作用于鄰近器官肺[9]。而此時(shí)炎性細(xì)胞因子與肺部效應(yīng)細(xì)胞共同參與，進(jìn)一步發(fā)生級(jí)聯(lián)放大的炎癥繼發(fā)性損傷，引起多種炎性細(xì)胞因子與氧自由基的積聚，造成炎性介質(zhì)的泛濫，肺內(nèi)促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子失衡，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫[10～12]。

本研究病理結(jié)果顯示，I/R組肺組織損傷程度明顯增加，出現(xiàn)肺泡及間質(zhì)水腫、肺毛細(xì)血管擴(kuò)張及中性粒細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為肺泡壁嚴(yán)重受損出血和斷裂情況嚴(yán)重，較多的急、慢性炎性細(xì)胞浸潤，胞質(zhì)深染，部分肺泡萎縮提示心肌缺血/再灌注后肺組織損傷嚴(yán)重，心肌缺血/再灌注損傷后急性肺損傷模型成功建立。此外，I/R組中促炎性細(xì)胞因子增多而抗炎性細(xì)胞因子減少，氧自由基含量增多，進(jìn)一步證實(shí)了糖尿病心肌缺血/再灌注致急性肺損傷機(jī)制與炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)。

低氧誘導(dǎo)因子HIF是在缺血缺氧狀態(tài)下被激活的一種轉(zhuǎn)錄因子，可以通過調(diào)節(jié)下游多種靶基因，參與血管生成、葡萄糖代謝及氧運(yùn)輸?shù)榷喾N途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而發(fā)揮肺保護(hù)作用[13]。McClendon等[14]研究發(fā)現(xiàn)HIF可作用于肺部，修復(fù)損傷的肺泡上皮細(xì)胞，使肺組織耐受缺氧狀態(tài)，抑制氧自由基的積聚，減輕肺部炎性反應(yīng)從而發(fā)揮肺保護(hù)作用。此外HIF-1α激活能夠降低肺氧耗量，維持氧供需平衡，修復(fù)已受損的肺泡毛細(xì)血管，發(fā)揮肺保護(hù)作用。然而，在筆者前期研究中也發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下HIF信號(hào)通路處于失活狀態(tài)，心肌缺血/再灌注損傷更加嚴(yán)重，因此本研究使用尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α的方法，外源性提高HIF-1α，恢復(fù)HIF-1α活性，探討糖尿病狀態(tài)下缺血后處理是否具有肺保護(hù)作用[5,15]。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病小鼠中IPostC組只能輕微緩解肺損傷程度，肺泡壁周圍仍有出血和大量炎性細(xì)胞浸潤；而與IPostC組比較，HIPostC組肺泡壁水腫、斷裂及出血情況均顯著減輕，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)完整；提示糖尿病狀態(tài)下rAAV9-HIF-1α+缺血后處理這一措施，對(duì)于心肌缺血/再灌注后受損的肺組織具有一定程度的保護(hù)作用。

此外，尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后HIPostC組中的HIF-α含量顯著增高，促炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α減少，抗炎性細(xì)胞因子IL-10相對(duì)增多，達(dá)到炎性細(xì)胞因子相對(duì)平衡的狀態(tài)，從而發(fā)揮肺保護(hù)作用。與此同時(shí)，HIPostC組過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物MDA的含量減少，氧自由基清除劑SOD的活性提高，提示氧自由基的含量明顯減少。由此筆者考慮缺血后處理發(fā)揮肺保護(hù)作用與激活HIF信號(hào)通路，減輕肺部炎性反應(yīng)，修復(fù)受損的肺泡毛細(xì)血管，改善血管通透性有關(guān)；糖尿病狀態(tài)下HIF信號(hào)通路弱化，但若外源性提高體內(nèi)HIF-1α的含量恢復(fù)其活性，缺血后處理可在一定程度上恢復(fù)肺保護(hù)作用。

綜上所述，尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后缺血后處理可減輕心肌缺血/再灌注所致的急性肺損傷，其發(fā)揮作用可能與調(diào)控促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子的平衡，抑制氧化應(yīng)激，激活HIF信號(hào)通路相關(guān)。