謝 軻 周明敏 何 燕 李棣文 劉 育

心臟性猝死(SCD)是心血管疾病所致死亡的主要原因之一，其常由急性心肌梗死(AMI)后惡性室性心律失常(VAs)所致。心臟交感神經(jīng)的激活被認(rèn)為是AMI后惡性VAs的重要因素之一[1]。既往研究表明，左側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)(LSG)干預(yù)(例如外科手術(shù)切除、化學(xué)物質(zhì)損毀和局部神經(jīng)阻滯等)抑制交感神經(jīng)活性是預(yù)防AMI后惡性VAs發(fā)生的措施之一[2, 3]。瞬時(shí)電位感受器香草酸受體1(TRPV-1)是一種于神經(jīng)組織中廣泛表達(dá)的非選擇性陽(yáng)離子通道，既往研究發(fā)現(xiàn)TRPV-1在中樞神經(jīng)組織中與酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性神經(jīng)元存在廣泛共表達(dá)[4]。樹(shù)膠脂毒素(RTX)能選擇性損毀TRPV-1陽(yáng)性的神經(jīng)元，而不損傷周圍，TRPV-1陰性的神經(jīng)元[5,6]。因此，本研究旨在通過(guò)RTX微量注射化學(xué)損毀LSG中TRPV/TH陽(yáng)性的交感神經(jīng)元，探討其對(duì)AMI后VAs發(fā)生和心臟電生理特性的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:本研究通過(guò)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)(WSRM20171224)。健康成年雄性比格犬28只(體質(zhì)量為9.5～11.0kg)，購(gòu)自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司并飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法將28只犬隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(8只)、AMI組(11只)和RTX組(9只)。實(shí)驗(yàn)犬使用3%戊巴比妥緩慢注入前肢淺靜脈麻醉，隨即氣管插管，接大動(dòng)物呼吸機(jī)(MAO01746，美國(guó)Harvard Apparatus公司)正壓機(jī)械通氣，肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG)持續(xù)監(jiān)測(cè)。每小時(shí)末添加2mg/kg戊巴比妥鈉作為手術(shù)期間的維持劑量，并通過(guò)檢查角膜反射來(lái)評(píng)估麻醉深度，所有手術(shù)操作均在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行。通過(guò)股靜脈鞘管向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物持續(xù)滴注0.9%氯化鈉溶液(50～70ml/h)以補(bǔ)充體液丟失。犬的體溫通過(guò)加熱墊維持在36.5±1.5℃。左側(cè)第二和第四肋間開(kāi)胸，剪開(kāi)心包縫制心包吊橋，操作過(guò)程中避免動(dòng)物的肺部損傷并保證其濕潤(rùn)。通過(guò)右側(cè)股動(dòng)脈連接壓力換能器持續(xù)監(jiān)測(cè)血壓。所有心電信號(hào)和血壓信號(hào)均通過(guò)Lead-7000多導(dǎo)電生理儀系統(tǒng)(四川錦江電子公司)實(shí)時(shí)采集監(jiān)測(cè)。

2.模型的建立:預(yù)先將1mg RTX(美國(guó)Sigma公司)溶于0.1ml DMSO(美國(guó)Sigma公司)中，配成10mg/ml的儲(chǔ)存液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，使用前用等滲0.9%氯化鈉溶液稀釋至最終濃度(250μg/ml)。第2肋間開(kāi)胸后，尋找并分離LSG，在直視下將總量為0.1ml的RTX多點(diǎn)注射至LSG中。對(duì)照組和AMI組犬微量注射不含RTX的溶劑。AMI組(溶劑注射后60min)和RTX組(RTX注射后60min)通過(guò)分離犬冠狀動(dòng)脈左前降支并于第1對(duì)角支以下結(jié)扎的方式建立AMI模型。通過(guò)觀察ECG ST-T及心肌顏色的變化來(lái)確認(rèn)AMI模型建立成功。對(duì)照組只分離穿線，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

3.VAs的觀察:由多導(dǎo)電生理儀系統(tǒng)連續(xù)記錄AMI后1h內(nèi)VAs發(fā)生情況，對(duì)照組記錄分離冠狀動(dòng)脈后1h的ECG改變。并將VAs分為室性期前收縮(VPB)，室性心動(dòng)過(guò)速(VT，≥3個(gè)連續(xù)VPB)和心室顫動(dòng)(VF)等3種類型進(jìn)行分析。

4.LSG功能評(píng)估：冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后1h，在LSG不同部位發(fā)放高頻電刺激進(jìn)行試探性刺激，將刺激時(shí)血壓升高最明顯的部位定義為血壓變化最大的位點(diǎn)，在此刺激位點(diǎn)固定刺激銀絲，測(cè)定不同強(qiáng)度電壓刺激(從2.5V開(kāi)始，以2.5V逐步遞增直至12.5V，刺激持續(xù)時(shí)間30s)LSG引起的最大收縮壓變化百分比(MSBP%)，以此評(píng)價(jià)LSG功能。

5.心臟電生理參數(shù)的測(cè)量：(1)有效不應(yīng)期(ERP)及其離散度：將自制電極縫制于左心室表面，記錄冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后1h缺血區(qū)和非缺血區(qū)(對(duì)照組于對(duì)應(yīng)時(shí)間記錄心尖部和心底部)的ERP。通過(guò)程控期前刺激測(cè)量缺血區(qū)和非缺血區(qū)的ERP，其包括8個(gè)連續(xù)的S1刺激，起搏周長(zhǎng)為300ms，此后再接一個(gè)S2刺激。S1-S2間隔從250ms逐漸減少10ms，當(dāng)S2不能奪獲心室時(shí)，從上一個(gè)S1-S2間隔起始以2ms遞減直到最終無(wú)法奪獲心室。ERP定義為未能奪獲心室的最長(zhǎng)S1-S2間期。ERP離散度定義為缺血區(qū)和非缺血區(qū)ERP的標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù)。(2)單向動(dòng)作電位(MAP)的記錄及相關(guān)分析：將自制刺激電極縫于左心耳上，采用300ms S1-S1周長(zhǎng)固定起搏，用自制針狀A(yù)g-AgCI MAP記錄電極分別記錄結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后1h缺血區(qū)和非缺血區(qū)(對(duì)照組于相應(yīng)時(shí)間記錄心尖部和心底部)的MAP，計(jì)算MAP復(fù)極90%的時(shí)程(MAPD90)。

結(jié) 果

本研究中，對(duì)照組8只全部存活。AMI組3只，RTX組1只死于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后心室顫動(dòng)(此4只犬僅納入心室顫動(dòng)發(fā)生率分析)，其余犬均完成全部實(shí)驗(yàn)。

1.3組犬VAs發(fā)生情況比較：冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后在實(shí)驗(yàn)犬ECG中均觀察到ST段變化及VAs發(fā)生，包括VPB、VT及VF。與對(duì)照組比較，AMI組VPB、VT和VF發(fā)生率及VT持續(xù)時(shí)間顯著增加(P<0.05)。與AMI組比較，RTX組顯著減少AMI后VAs的發(fā)生(P<0.05,表1)。

表1 3組犬VAs發(fā)生的比較

2.3組犬LSG功能的比較:LSG功能被用于評(píng)估交感神經(jīng)活性。3組犬LSG在不同電壓刺激下所誘發(fā)的MSBP%見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，AMI組引起MSBP%顯著增加；與對(duì)照組和AMI組比較，RTX組RTX處理顯著降低MSBP%(P<0.05,表2)。

表2 3組犬LSG功能的比較

3.3組犬電生理指標(biāo)的比較:與對(duì)照組比較，AMI組左心室缺血區(qū)ERP及MAPD90均顯著縮短，ERP離散度和MAPD90離散度顯著增加(P<0.05)。與AMI組比較，RTX組RTX處理延長(zhǎng)左心室缺血區(qū)的ERP及MAPD90，減少ERP離散度和MAPD90離散度(P<0.05)。與對(duì)照組比較，AMI組非缺血區(qū)ERP和MAPD90比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而RTX組ERP和MAPD90顯著延長(zhǎng)(P<0.05,表3)。

表3 3組犬ERP及其離散度、MAPD90及其離散度的比較

討 論

本研究通過(guò)LSG微量注射RTX化學(xué)損毀TRPV-1/TH陽(yáng)性的神經(jīng)纖維，顯著延長(zhǎng)AMI后ERP和MAPD90并減小ERP和MAPD90離散度(表3)。因此，可以證明RTX處理獲得了與交感神經(jīng)阻滯相同的效果，即抑制交感神經(jīng)活性，從而改善心臟的電不穩(wěn)定性。綜上所述，筆者可以推測(cè)RTX通過(guò)化學(xué)損毀LSG中TRPV-1/TH陽(yáng)性的交感神經(jīng)纖維，有效抑制LSG功能，從而改善心臟電生理穩(wěn)定性并減少AMI后VAs的發(fā)生。

AMI后VAs的治療是目前的研究熱點(diǎn)，自主神經(jīng)調(diào)節(jié)是AMI后VAs的治療選擇之一[15，16]。目前臨床上調(diào)節(jié)自主神經(jīng)平衡的手段有限，除了β受體阻滯劑一類的藥物外，并無(wú)其他更好的方法。心臟交感神經(jīng)切除術(shù)雖然有確切的效果，但因?yàn)槿菀壮霈F(xiàn)各種并發(fā)癥，包括血?dú)庑?、術(shù)后感染及Horner綜合征等，此外對(duì)手術(shù)操作者的技術(shù)水平要求也很高，所以很少在臨床上使用[17]。既往研究顯示，去腎交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)刺激及心房自主神經(jīng)節(jié)刺激等能有效促進(jìn)AMI后自主神經(jīng)再平衡，但相關(guān)臨床研究較少，仍需獲取進(jìn)一步的臨床證據(jù)[18～20]。各種去LSG的方式包括手術(shù)、藥物損毀(乙醇等)雖然可減少M(fèi)I后VAs的發(fā)生，但也存在著一些問(wèn)題，如LSG局部解剖復(fù)雜，神經(jīng)血管豐富且功能關(guān)鍵，易造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。而在本研究中，RTX是一種有效的TRPV-1激動(dòng)劑，它通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)的游離鈣大量增加，在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)鈣細(xì)胞毒性，快速清除TRPV-1陽(yáng)性神經(jīng)纖維，從而減少LSG中表達(dá)TH交感神經(jīng)纖維數(shù)量。其他不表達(dá)TRPV-1的臨近神經(jīng)纖維或細(xì)胞將不受影響，包括少量TRPV-1陰性TH陽(yáng)性神經(jīng)纖維和衛(wèi)星細(xì)胞[6]。此外，筆者采用星狀微量注射來(lái)減小RTX干預(yù)出現(xiàn)解剖學(xué)脫靶的概率以及對(duì)血壓和心率的影響，就其特異性、安全性及有效性，RTX化學(xué)消融LSG中TRPV-1/TH陽(yáng)性的交感神經(jīng)纖維為AMI后VAs的預(yù)防及治療提供了一個(gè)新的選擇。

本研究存在的不足之處：(1)筆者沒(méi)有進(jìn)行RTX處理LSG前后 TRPV-1/TH陽(yáng)性神經(jīng)元的定量分析，沒(méi)有得到RTX處理后交感神經(jīng)減少的直接證據(jù)。其次，TH陰性而TRPV-1陽(yáng)性神經(jīng)纖維的生理作用尚不清楚，這可能需進(jìn)一步研究。(2)筆者的研究?jī)H限于RTX神經(jīng)節(jié)內(nèi)微量注射對(duì)AMI模型的短期影響，它對(duì)心臟電生理、自主神經(jīng)系統(tǒng)及心臟重構(gòu)的長(zhǎng)期影響仍需要在未來(lái)的研究中得到印證。(3)未評(píng)估達(dá)到最佳抗心律失常和最小不良反應(yīng)的RTX濃度。