易 波 蔡玉立 李俊峰 包 艷 陳小琳 文重遠(yuǎn)

心血管疾病是嚴(yán)重危害我國人民群眾生命健康的慢性非傳染性疾病之一，但目前仍缺乏有效的干預(yù)手段[1]。再生基因蛋白3β(regenerating islet-derived protein 3 beta，Reg3β)是新近發(fā)現(xiàn)具有抗炎和抗凋亡作用的分泌性蛋白，結(jié)構(gòu)上屬于C型凝集素家族，其基因序列具有保守性[2～5]。在自身免疫性心肌炎、缺血性心臟病和心肌肥厚等動(dòng)物模型中，Reg3β僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)增多，而心臟組織非心肌細(xì)胞中均無表達(dá)[3,6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，Reg3β不僅與心力衰竭患者的心功能分級(jí)和急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者心肌炎性反應(yīng)強(qiáng)度相關(guān)，還能預(yù)測(cè)心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)，更能修復(fù)大鼠心臟功能、改善心肌梗死預(yù)后[3，6，8]。提示Reg3β不僅是心血管疾病的臨床評(píng)估和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，還具有潛在的心肌保護(hù)功能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

因此，本研究擬構(gòu)建Reg3β干擾載體，并在H9C2大鼠心肌細(xì)胞中優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，鑒定抑制效果，為深入探索Reg3β在心血管疾病的作用提供有利的工具。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：大鼠心肌細(xì)胞H9C2來源于武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。Reg3β-shRNA由上海吉瑪公司合成，pG1.2空白載體由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司提供，該載體含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)。感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α及無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒來源于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。DNA引物由上海吉瑪公司合成；質(zhì)粒測(cè)序由深圳華大基因研究院完成。Lipofectamine2000、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑和Opti-MEM培養(yǎng)基均來源于美國Invitrogen公司。羊抗大鼠Reg3β抗體購自美國R&D公司(貨號(hào)AF1996)，抗鼠β-actin抗體、抗羊二抗、抗小鼠二抗均購自北京四正柏生物科技有限公司。

2.Reg3β干擾表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與篩選：檢索GeneBank以獲取大鼠Reg3β mRNA基因全序列(RefSeq ID：NM_053289.1；Gene ID：24618)，從起始密碼子AUG快開始尋找“AA”二連序列，以其3′端的19個(gè)堿基序列為潛在的siRNA靶點(diǎn)。據(jù)此選出3條合適的目標(biāo)序列及其抑制靶點(diǎn)和1條空白對(duì)照序列由上海吉瑪公司合成基因片段。隨后將合成的siRNA以脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞中，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Reg3β mRNA表達(dá)量，以此計(jì)算3條干擾片段的抑制率[抑制率(%)=(1-各組Reg3β變化倍數(shù))×100%]，從而篩選合適的基因片段用于構(gòu)建shRNA(表1)。

3.shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)pG1.2表達(dá)質(zhì)粒的要求，在干擾片段5′端加入一個(gè)SacⅠ的酶切位點(diǎn)(GAGCTC)，3′端加入LOOP環(huán)序列(TTCAAGACG)，接著加入其反向互補(bǔ)序列，最后加上終止密碼子序列TTTTTTG、SacⅠ酶切位點(diǎn)和BsaⅠ酶切位點(diǎn)。按照同樣方法得到其反義鏈序列。隨后將前述正義鏈和反義鏈于94℃退火成雙鏈DNA，同時(shí)利用BsaⅠ酶切pG1.2質(zhì)粒得到線性化載體，將兩者在T4連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。

4.shRNA表達(dá)載體的驗(yàn)證：將10μl前述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，并均勻涂布與含有卡那霉素的篩選培養(yǎng)板上，挑取數(shù)個(gè)單克隆菌落接種于5ml含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后使用SacⅠ酶切鑒定，并將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

5.H9C2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)：參考美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)建議，大鼠H9C2心肌細(xì)胞置于含4.5g/L葡萄糖和10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)的DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)中，在37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于細(xì)胞密度在80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9C2細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)過夜后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6.shRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化：轉(zhuǎn)染前2h將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清DMEM培養(yǎng)基。用opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋質(zhì)粒和Lipofectamine2000或Lipofectamine3000，混勻后室溫靜置5min。Lipofectamine2000和Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑均以質(zhì)?！棉D(zhuǎn)染試劑=1μg∶2μl和1μg∶3μl的比例配置配制質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物250μl，靜置20min后加入H9C2細(xì)胞內(nèi)輕輕混勻。6h后吸出復(fù)合物，換入正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48h后于倒置顯微鏡下觀察EGFP自發(fā)熒光強(qiáng)度以明確轉(zhuǎn)染效率。

7.H9C2細(xì)胞內(nèi)干擾效果鑒定：轉(zhuǎn)染共分成3組,即空白組、pG1.2-Reg3β shRNA組和shRNA對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。6孔板中接種H9C2細(xì)胞后，按shRNA最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件，依次加入無血清培養(yǎng)基250μl、pG1.2-Reg3β shRNA混合物250μl、pG1.2空白載體混合物250μl。繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞進(jìn)行Reg3β mRNA和蛋白檢測(cè)。

8.q-PCR檢測(cè)Reg3β mRNA表達(dá)量：以Trizol法(美國Ambion公司)提取細(xì)胞總RNA并檢測(cè)其濃度后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR Green Master Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到各種Ct值，反應(yīng)條件為50℃ 2min，95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，60℃退火30s，共40 個(gè)循環(huán)。大鼠β-actin引物序列為上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′；下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，大鼠Reg3β引物序列為上游引物：5′-GCTCCTACTGCTATGCCCTGTT-3′；下游引物：5′-TTACTCCACTCCCATCCACCTC-3′。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算各組Reg3β mRNA表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)量的變化倍數(shù)即為Reg3β mRNA相對(duì)表達(dá)量。

9.Western blot法檢測(cè)Reg3β蛋白表達(dá)量：以RIPA裂解液常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液后于100℃變性蛋白。上樣后經(jīng)15%分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移至0.22μm PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1h，依次加入Reg3β和β-actin一抗(稀釋比均為1∶1000)及相應(yīng)二抗進(jìn)行孵育，以超敏ECL法進(jìn)行顯色。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：多組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.靶向Reg3β mRNA的干擾片段篩選：如表1所示，設(shè)計(jì)的3條shRNA分別針對(duì)Reg3β mRNA第159～178位堿基、第195～214位堿基和第284～303位堿基，其抑制率分別位67.93%、28.14%和36.19%。因此，選擇抑制率最高的第一條干擾序列(即Reg3β shRNA-1)為基礎(chǔ)構(gòu)建shRNA。

表1 Reg3β shRNA基因片段序列、靶點(diǎn)及抑制率

2.Reg3β-shRNA表達(dá)載體的酶切和測(cè)序鑒定：因pG1.2質(zhì)粒里面只有一個(gè)SacⅠ的酶切位點(diǎn)，因此在構(gòu)建Reg3β-shRNA時(shí)于干擾片段前加入另一個(gè)SacⅠ的酶切位點(diǎn)，當(dāng)質(zhì)粒被SacⅠ酶切出一條約600bp DNA條帶時(shí)，說明退火片段連接到pG1.2載體里。酶切結(jié)果顯示Reg3β-shRNA經(jīng)SacⅠ酶切后與預(yù)期結(jié)果一樣出現(xiàn)600bp的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)構(gòu)證實(shí)構(gòu)建的Reg3β-shRNA與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)序列一致，且干擾片段前有SacⅠ酶切位點(diǎn)(GAGCTC)，詳見圖2。

圖1 pG1.2-Reg3β shRNA酶切驗(yàn)證

圖2 pG1.2-Reg3β shRNA測(cè)序驗(yàn)證

3.H9C2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化：將兩種轉(zhuǎn)染試劑和Reg3β shRNA以不同比例混勻，48h后用倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lipofectamine3000(1μg∶3μl)的轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)50%，而Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率均不足10%(圖3)。

圖3 不同條件下pG1.2-Reg3β shRNA轉(zhuǎn)染H9C2的熒光顯微鏡圖(×40)

4.H9C2細(xì)胞內(nèi)Reg3β 干擾效果評(píng)估：將Reg3β shRNA按最優(yōu)條件轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，48h后以q-PCR和Western blot法鑒定干擾效果(圖4)。與空白組比較，Reg3β shRNA可使mRNA相對(duì)表達(dá)量下降60%以上(P<0.01)，Reg3β蛋白表達(dá)量下降50%左右(P<0.05)，而shRNA對(duì)照組不抑制Reg3β表達(dá)(P>0.05)。

圖4 q-PCR和Westem blot法評(píng)估pG1.2-Reg3β shRNA抑制效果

討 論

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，糖尿病、肥胖、高脂血癥、高血壓等心血管疾病高危因素流行趨勢(shì)明顯，在今后較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，心血管疾病患病人數(shù)將會(huì)急劇增加[1, 9]。因此，及時(shí)針對(duì)心血管疾病開展發(fā)病機(jī)制、診斷、干預(yù)治療的相關(guān)研究，有助于提高患者生命質(zhì)量，有著重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。

Reg3β是具有進(jìn)化保守性分泌蛋白。大鼠Reg3β位于4q33(NC_005103.4),含6個(gè)外顯子，共編碼188個(gè)氨基酸；小鼠Reg3β位于6C3(NC_000072.6),含6個(gè)外顯子編碼175個(gè)氨基酸。在人體中該蛋白又稱為Reg3A(再生基因蛋白3A，Regenerating Islet-Derived Protein 3-Alpha)，位于2p12(NC_000002.12)，含6個(gè)外顯子，編碼175個(gè)氨基酸。人Reg3β與大鼠Reg3β具有72.99%的基因序列一致性，與小鼠Reg3β的基因序列一致性為75.1%，氨基酸序列一致性為70%，與小鼠Reg3α、Reg3γ、Reg3δ等其他家族成員的氨基酸序列一致性低至50%[10]。研究表明，針對(duì)重組人Reg3β蛋白設(shè)計(jì)的抗體能與小鼠Reg3β具有交叉反應(yīng)，證實(shí)Reg3β在不同物種中可能具有類似的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[4,10]。因此，研究大鼠Reg3β的功能有助于深入理解該蛋白在人體中的潛在作用。

Reg3β雖然在體內(nèi)許多組織和細(xì)胞均有表達(dá)，但在心血管疾病中僅特異性表達(dá)于心肌細(xì)胞，具有潛在的心肌保護(hù)作用。生理狀態(tài)下，Reg3β僅表達(dá)于小腸、胰島α細(xì)胞、分泌生長(zhǎng)激素的細(xì)胞、子宮等組織。在某些疾病時(shí)許多組織會(huì)高表達(dá)Reg3β蛋白，例如急性胰腺炎時(shí)的胰腺組織、糖尿病大鼠胰島組織、再生的胰島β細(xì)胞、腫瘤組織、受損的神經(jīng)組織等[4]。在自身免疫性心肌炎、缺血性心臟病和心肌肥厚等動(dòng)物模型中，Reg3β僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)增多，而心臟組織非心肌細(xì)胞中均無表達(dá)[3,6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，Reg3β能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向心肌受損部位浸潤以清除中性粒細(xì)胞殘骸，進(jìn)而修復(fù)心臟功能，提高小鼠梗死后存活率[3]。雖然既往研究證實(shí)Reg3β既能減少TNF-α、IL-1β和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，又能抑制β細(xì)胞和胰腺癌的凋亡，但其是否通過抗炎和抗凋亡作用而保護(hù)心肌細(xì)胞仍有待深入研究[2,4,5,11]。

目前研究Reg3β功能及機(jī)制的常用方法是外源性Reg3β蛋白干預(yù)、Reg3β全身敲減小鼠、Reg3β過表達(dá)小鼠、以及下游gp130/JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑等[3～5,12]。RNA干擾技術(shù)可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)序列特異的靶基因表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象，為探索Reg3β功能及機(jī)制提供了新的維度。因此，本實(shí)驗(yàn)采用pG1.2干擾表達(dá)載體，帶有EGFP綠色熒光標(biāo)記和CCDB基因，其中EGFP用于細(xì)胞內(nèi)觀察shRNA表達(dá)情況，CCDB基因可用于篩選線性化的載體。本研究利用設(shè)計(jì)的3條Reg3β siRNA，篩選出抑制效率最高達(dá)到67.93%的抑制序列，進(jìn)而成功構(gòu)建了pG1.2-Reg3β shRNA沉默載體，既能瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以短暫的降低Reg3β的表達(dá)，也希望包裝成病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞以獲得穩(wěn)定表達(dá)株。

大鼠H9C2細(xì)胞是研究心肌細(xì)胞功能的常用細(xì)胞株之一，既能用于研究心力衰竭相關(guān)基因如基質(zhì)金屬蛋白酶-2的作用，還能用于心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性研究[13]。此外，在H9C2細(xì)胞中，高濃度葡萄糖能誘導(dǎo)凋亡和炎性反應(yīng)，并能夠觀察到降糖藥物二甲雙胍和腸促胰素樣肽(GLP-1)受體激動(dòng)劑的心肌保護(hù)作用[14, 15]。但早期研究發(fā)現(xiàn)，在陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體模型下，H9C2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于HEK293細(xì)胞，影響了該細(xì)胞的科研應(yīng)用[13]。因此，為獲得高效無毒的H9C2細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，筆者優(yōu)化摸索兩種常用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000和Lipofectamine3000的轉(zhuǎn)染條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pG1.2-Reg3β shRNA沉默載體：Lipofectamine3000比例為1μg∶3μl時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到50%，明顯高于其他轉(zhuǎn)染模式。倪銀蕓等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Lipofectamine3000細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染EGFP-LC2質(zhì)粒的效率也顯著高于Lipofectamine2000、FuGen HD和DNA-In CRISPR等3種轉(zhuǎn)染方法，推薦用于H9C2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。

在此基礎(chǔ)上，本研究以最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件將成功構(gòu)建的pG1.2-Reg3β shRNA沉默載體轉(zhuǎn)入H9C2細(xì)胞，PCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，Reg3β表達(dá)的抑制率可達(dá)到50%以上。但本研究也存在一定的局限性，如pG1.2-Reg3β shRNA抑制效果僅為50%以上，酶切驗(yàn)證時(shí)未能將同時(shí)將空白載體和pG1.2-Reg3β shRNA放在一起進(jìn)行驗(yàn)證，細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件需要進(jìn)一步優(yōu)化，亦未能在病理?xiàng)l件下(如高血糖)觀察該載體的抑制效果。無論如何，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的pG1.2-Reg3β shRNA有望為后續(xù)深入探討Reg3β在心血管疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。